PCR技术及其应用

1、PCR技术及其医学应用,武汉大学医学院 病毒所分子生物学研究室,Polymerase chain reaction The polymerase chain reaction (PCR)：to amplify a sequence of DNA using a pair of primers each complementary to one end of the the DNA target sequence. 1985年，美国Cetus 公司和加利福尼亚大学联合创建了一种核酸体外扩增技术,第一节 PCR原理与特点,一、PCR基本原理 PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法， 其基本原理

2、是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,Denaturation （变性）: The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95 Primer annealing （引物退火）: The temperat

3、ure is reduced to around 55 to allow the primers to anneal. Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72 for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg,How PCR works,PCR proceeds by sequential cycles of: 1.DNA denaturation The sample DNA is denature

4、d with heat to form single stranded DNA. 与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95 左右的高温使其产生变性，形成单链DNA而游离于反应溶液中,2.单链DNA模板与引物退火(annealing) The primers are annealed to the single stranded DNA by cooling the sample. 通常需要两个寡核苷酸作DNA合成的引物(primer)，这两个引物分别与待扩增顺序两侧的模板DNA互补，在降低温度的过程中，通过控制退火条件， 引物就能准确地配对在扩增区域的两侧,Primer

5、s 引物,PCR primers：about 18 to 30 nt long and with similar G+C contents. Tm=2(a+t)+4(g+c): determine annealing temperature. If the primer is 18-30 nt, annealing temperature can be Tm5oC,3.引物的延伸(extension) The primers are extended in the presence of DNA polymerase and deoxyribonucleoside triphosphates,

6、 and complementary copies of the target DNA is produced PCR 在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸(dNTP)按引物5-3方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的半保留复制链，新合成的链又作为下轮循环反应的模板,Enzymes for PCR,The most common is Taq polymerase from Thermus aquaticus. It has no 3 to 5 proofreading exonuclease activity. Accuracy is low,

7、not good for cloning,The cycle is then repeated 以上“变性、退火、延伸”三步曲，被确定为PCR的一轮循环，整个PCR过程一般只需30个循环,This process will amplify the original DNA exponentially so that about 1 million copies of the original sequence are present after 20 cycles (220), and 1 billion are present after 30 cycles (230). PCR的扩增倍数为

8、(1+x)n，x为扩增效率，平均为75，n 为PCR的循环次数,尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA 顺序的指数扩增并不是一个无限制的过程。通常在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，产物的量不再增加。“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能，模板DNA的拷贝数，底物dNTP浓度及多种因素,二、PCR技术的特点 1.高度的敏感性 单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数也在一百万倍以上，即可将极微量(pg级)DNA，扩增到紫外光下可见的水平(g级)。 它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析,2.高度的特异性 PCR扩增的特异性

9、依赖于两个引物设计的特异性， 依赖于引物与模板结合的正确性。PCR反应时退火的温度对特异性也有影响. 在PCR实验中，只要引物设计合理，反应温度适宜，采用高温启动法PCR 扩增的特异性是相当高的,3.操作简便、快速 4.适用样品的广泛性 既可是DNA，也可是RNA；既可是纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织，也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、培养细胞、血细胞），又可是体液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA,第二节 PCR系统的组成及PCR最适条件,PCR系统是由耐热DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸、待扩增的DNA(RNA)和缓冲液组成,一、耐热DNA聚合酶

10、 耐热DNA聚合酶引入PCR后，使其操作大大简化,TaqDNA聚合酶的特性： 以DNA为模板，从结合在特定DNA模板上的引物为出发点， 将种脱氧核苷酸以碱基配对方式，按引物5-3的方向，合成新的DNA链；有逆转录活性， 而无Klenow 酶所具有的3-5外切酶活性；可在新合成双链产物的末端加上一个非模板依赖的碱基， 且优先聚合A，利用这种特性可以构建dT-载体来克隆带dA尾的PCR产物,因TaqDNA酶没有3-5外切酶活性，故无校正功能，错误频率为0.25，即在25轮循环后，其扩增产物的顺序中400个碱基可能出现一个篡改（错误掺入）碱基,二、寡核苷酸引物 PCR requires the sy

11、nthesis of oligonucleotide primers complementary to the target DNA. The entire sequence of the target DNA does not need to be known, only the flanking regions. 就整个PCR扩增技术而言，引物的设计占有十分重要的地位， 它的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否,引物的设计原则： 引物长度在1530碱基。引物过短，会使特异性降低。 引物中碱基的分布是随机的，避免个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在4550左右,避免两引物间的互补，

12、特别是3端互补，以免形成二聚体。 引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性,引物的3端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。 引物的5端限定着PCR产物的长度，可根据产物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法,引物与非扩增序列的同源性不应超过70。 如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第位。 目前，国内外已有许多专门用于引物设计的计算机程序，简化了引物的设计过程,三、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称。 在PCR循环中，高浓度的dNTP可加快反应速度， 但增加了碱基的错误掺入率和实验

13、成本；反之，低浓度的dNTP会导致反应速度下降，但可提高实验的精确性,四、PCR反应缓冲液 用于PCR反应的缓冲液一般都有Tris-clPH8.3-8.8) Kcl、NH42SO4, Mgcl2，明胶和甲酰胺。 其中以Mg2+最为关键，它是TaqDNA 聚合酶所必需的，Mg2+浓度可影响酶活性与精确度， 以及产物的特异性等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时则酶催化非特异性扩增,五、模板DNA PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增. 核酸标本来源广泛. 注意核酸标本中不要含DNA聚合酶抑制剂,六、PCR循环数 其它参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论

14、上说25次循环后，PCR产物的积累即达最大值。实际操作中由于每步反应不可能达100效率，一般按75计算，30次是比较合理的循环次数,七、易发生的问题及解决方法 (1)没有得到所希望的PCR产物（假阴性）： 是否加入了TaqDNA酶，及酶活性如何。 DNA解链是否充分。要注意是否达到了解链温度（解链不完全往往是失败的重要原因）； 样品中可能有酶抑制剂，用95加热10分钟将其失活； 使用多组合引物，作双PCR,2)所有样品均为阳性（假阳性）： 设立阴性对照，空白对照； 样品收集、处理时避免操作污染； 避免阳性对照样品对检测样品的污染。 (3)PCR产物呈片状： 减少聚合酶浓度；增加退火温度； 减少

15、循环周期,4)出现非特异性扩增 基因组DNA作为模板时，由于其数量的庞大及结构复杂，除了特异扩增外，往往很容易产生非特异扩增产物。增加退火温度，减少退火时间及延伸时间；降低引物及TaqDNA酶浓度；改变Mg2+的浓度,PCR The PCR cycle （循环） Template （模板） Primers （引物） Enzymes （酶） PCR optimization （优化,第三节 PCR技术的发展 随着分子生物学的发展，PCR技术本身也在不断地完善和发展。目前PCR及其衍生技术已应用于外源基因的分离、基因重组、DNA测序、构建克隆与表达载体、 定点突变、检测某基因多态性、转座子插入位点

16、绘图、检测基因修饰等,一、PCR克隆技术 PCR克隆技术有：粘端克隆法、钝端克隆法、无连接酶的亚克隆法等。PCR产物粘端可用多种方法产生：引物5端附加碱基修饰法； 利用TaqDNA 聚合酶的类似TdT酶活性产生粘端；T4 DNA聚合酶在限制核苷酸的条件下使产物产生粘端,二、定量PCR 随着分子生物学的发展，特异核酸的定量在生物学中与临床上的重要性日趋增加，有关基因的定量工作大部分是对mRNA定量。 一个理想的定量PCR实验应设立内参照， 使内参照与待研究基因在同一反应管中进行。内参照可以是有限制位点的突变靶序列，也可以是与靶序列不相关的“报告者”(reporter) RNA,三、PCR与突变的

17、分子水平分析 已知突变的检测和未知突变的筛选方法较多，有：ASO法、AS-PCR法、单链构象多态性PCR、 引物竞争PCR法等。单链构象多态性(single-strand conformation polymorphisms, SSCP)是根据大小极相近的单链核酸分子在非变性条件下，电泳迁移率与其序列有关,八、逆转录PCR(RT-PCR) 逆转录PCR(RT-PCR)又称RNA-PCR。PCR不仅可以检测DNA，也能对RNA 进行分析和研究。反应的第一步是提取总RNA，加入一个与mRNA3端互补的引物， 在逆转录酶作用下合成cDNA；第二步是以cDNA为模板，再加入与cDNA互补的另一引物（两引物应位于不同的外显子上，以避免基因组DNA污染）进行PCR扩增,RT-PCR 可使所需模板mRNA 量大大减少， 因此对于低丰度mRNA 的cDNA克隆及cDNA文库的构建非常有利,第四节 PCR技术在医学上的应用 人类疾病的发生，常涉及到内源基因的