ctDNA筛查癌症的挑战与困惑ppt课件

1、ctDNA筛查癌症：思考与困惑,南海区人民医院 赵学峰,NIPT检验中发现意外孕妇肿瘤,450000例随访三年，其中79000 例深度研究追查 共计55 例无法报告NIPT结果，40例孕妇证明存在肿瘤，18 恶性、20例良性子宫纤维瘤 、2例有影像学表现而未经病理证实 孕妇NIP筛查获得意外肿瘤检验结果率1/万,Nilesh G. Dharajiya, Daniel S. Grosu, Daniel H. Farkas. Incidental Detection of Maternal Neoplasia in Noninvasive Prenatal Testing. Clinical Ch

2、emistry 64（2）：329335 (2018,4000例孕妇，发现3例癌症,Frdric Amant,PhD;Magali Verheecke,MDIwonaWlodars Presymptomatic Identification of Cancers in PregnantWomen During Noninvasive Prenatal Testing. AMA Oncology, 2015：E1-E6,我院：2017年有4例显示多重染色体异常，无追踪数据,正常人,13三体,乳腺癌,食道癌,卵泡淋巴瘤,术前,术后,NIPT的临床应用：6388例回顾分析,258/6,388 (4.

3、04%)筛查阳性,GrazianoPescia,NicolasGuex,ChristianIseli. Cell-free DNA testing of an extended range of chromosomal anomalies: clinical experience with 6,388 consecutive cases. Genetics in medicine，2016,ctDNA筛查胎儿异倍体的原理,肿瘤发生所涉及的基因变化,甲基化（SEPTIN 9) 点突变 拷贝数变化 转位与倒位,ctDNA筛查需要考虑解决方案,费用 相对于cffDNA，ctDNA浓度满足吗？ 点突变

4、的检测方法 CNV的检测方法 倒位与转位的检测方法 ctDNA与组织DNA的一致性及敏感性、特异性 全基因组测序Vs外显子测序Vs靶向panel测序 点突变、CNV的异常是否具有临床意义,NGS到底要花多少钱,NGS到底要花多少钱？ Illumina NextSeq500, HiSeq4000, HiSeqX5平台 全基因组测序：1669 ；全外显子测序： 792 靶基因组合测序 333 包含了样本制备、测序、拼接 非常依赖于技术熟练度，费用可相差2-5倍 没有计算仪器投入、人工、场地、后勤支持等费用 实际二代全基因组测序费用不低于5000美元/例,NGS的工作流程,测序深度 测序深度：测序得

5、到的碱基总量与基因组大小的比值 测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系 测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降 测序深度与花费呈正比,文库构建的作用,对于NIPT，成本也是个重要因素,ctDNA的生成与分类,ctDNA浓度受肿瘤大小、位置、分期影响 癌症早期ctDNA常1%，晚期约 10% ctDNA 概念：15 ctDNA 拷贝/ml外周血 0.1%的ctDNA基本低于NGS测序得错误临界点,胎儿ctDNA浓度与z评分、测序深度的关系,Ai-hua Yina, Chun-fang Peng. Noninvasive detection of fetal subchrom

6、osomal abnormalities by semiconductor sequencing of maternal plasma DNA. PNAS , 2015 （47）： 1467014675,ctDNA%含量、基因覆盖度、CNV片段大小关系,用CRISPR 相关蛋白9系统富集低频突变的cfDNA,切除、局部、转移肿瘤的ctDNA分布,可根除,局限性,转移癌,应用ctDNA作为肿瘤疗效与预后,ctDNA在手术切除肿瘤得患者可以作为预后/复发指标 在非手术切除肿瘤结论不一,从ctDNA来源考虑 肿瘤化疗导致肿瘤细胞死亡，ctDNA增多（不反映恶化） 肿瘤细胞自身凋亡导致ctDNA增多（

7、不反应恶化） 现实生活中难以不作治疗而静待ctDNA结果,ctDNA与肿瘤组织DNA的检测一致性,AmpliSeq Cancer panel (Life Tech):76% S. Xu, F. Lou, Y. Wu, D.Q. Sun, J.B. Zhang, W. Chen, et al., Circulating tumorDNA identified by targeted sequencing in advanced-stage non-small cell lung cancer patients, Cancer Lett. 370 (2) (2016) 324331. 胰腺导管癌K

8、ras检测：肿瘤组织阳性率91%，ctDNA80% 羊水细胞沉淀DNA与羊水上清ctDNA得出100%相同结果 造成不一致差异的原因 ctDNA的产量 ctDNA的质量 是疾病真正不均一性的体现 检测方法不足以敏感 肿瘤是以点突变为主还是CNV为主,Min Kyeong Kim,Sang Myung Woo,Boram Park. Prognostic Implications of Multiplex Detection of KRAS Mutations in Cell-Free DNA from Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

9、. Clinical Chemistry 64:4 726734 (2018,ctDNA检测肿瘤的实践（文献1,ctDNA检出率75% 的中晚期肿瘤：胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃和食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、头颈癌 ctDNA检出率50%：原发脑癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌 对于局部癌症：ctDNA 检出率分别是73%（大肠癌）, 57%（胃食管癌）, 48%（胰腺癌）, 50%（乳腺癌） 对于大肠癌： ctDNA检测KRAS 突变得敏感性87.2% 、特异性99.2,应用ctDNA对肝细胞肝癌的检测(应用实例1,来自肿瘤的ctDNA片段较短 85例A期肝癌和5例B期肝癌（巴塞罗那

10、分期标准） 研究表明：肝癌患者主要涉及1和8号染色体异常 84%的肝细胞肝癌存在1或8号染色体CNV缺失或增多 同时分析肿瘤组织和血浆ctDNA，取得63%的一致性 肿瘤组织检出而ctDNA阴性（21%）：可能反映肿瘤小，ctDNA量少 ctDNA检出而肿瘤组织阴性（15%）：反映肿瘤不均一性,红色：CNV增多 绿色：CNV缺失,Peiyong Jianga,Carol W. M. Chana, K. C. Allen Chan. Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients. www

11、./cgi/doi/10.1073/pnas.1500076112,应用ctDNA对大肠癌的检测(应用实例2,特点： 染色体臂水平的缺失主要发生在6, 8p, 14q and 1p, 拷贝数增多主要发生在19, 5, 2, 9p 和20p. 敏感性86.8%、特异性 56.3% 检出5例I期 患者,Cell Physiol Biochem 2018;45:1444-1454,患 者,健康人群,CNV的Z评分用于活动或恶性预测（黑色素瘤,CNV评分高于75th，预示活动病变 ROC：0.9 OR, 46.7 生存期：13.5月（75th）Vs 73.8月（75th,肿瘤发生时的C

12、NV变化,CNV是癌症发生的因素之一,26种癌症、3131病例，17% 基因呈现扩增、16% 缺失 正常人群 的扩增和缺失平均0.1-0.35% 癌症人群中，25%呈染色体臂得扩增或缺失，10%是大小不等局部片段扩增或缺失 每一局部片段不是扩增就是缺失，极少同时缺失或扩增,局部CNV变化可有多至几十倍得扩增和最低两条等位基因缺失（0） 染色体臂或整条染色体一般是3倍体扩增或单倍体缺失 各种癌症患者中，最常发生CNV变异的是 MYC 扩增和CDKN2A/B 缺失，总数占14,Rameen Beroukhim，Craig H.Mermel， Dale Porter，etal. The landsc

13、ape of somatic copy-number alteration across human cancers. NATURE| Vol 463| 18 February 2010,NGS平台检出ctDNA的CNV能力,假设目标片段仅存1个拷贝的增多或丢失 10% ctDNA时： 在1X 基因组覆盖度.可检出1Mb的CNV 1% ctDNA 时：在3*基因覆盖度可见出30Mb大小的CNV 0.5% ctDNA 时：在3*基因覆盖度可检出-100Mb大小的CNV 0.1% ctDNA 时：在131X基因覆盖度可检出100Mb大小的CNV 事实上癌症时，CNV增多常至少一个拷贝，检出能力理论

14、上高于上述表述,CNV检出率与测序深度、CNV片段大小,在胎儿ctDNA检测得表现 有创侵入获取DNA样本CGH 法比NIPT准确 在350万阅读深度，阳性率71.8% 42 of 45(93.3%)的CNV 5 Mb 35 of 35(100%) 的CNV10 Mb 仅有14 of 34 (41.2%) 的CNV5 Mb能被有效检出 当测序阅读范围扩展到1000万时，敏感性提升至94.5,不同癌症类型CNV检出数量与CNV片段大小,Molparia B, Nichani E, Torkamani A (2017) Assessment of circulating copy number v

15、ariant detection for cancer screening. PLOS ONE 12(7): e0180647. /10.1371/journal.pone.0180647 /plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0180647,至少一个CNV，5Mb,至少一个CNV，100Mb,2个CNV，5Mb,2个CNV，100Mb,100Mb： 真阳性85.4% 阳性预测值：99.7,5Mb： 真阳性89.5% 阳性预测值：99.5,CNV用于癌症组织起源的鉴别,高分辨率

16、（5Mb)与低分辨率（100Mb）CNV对组织起源鉴别无差异，而在于算法 胰腺腺癌、前列腺癌和甲状腺癌难以区分组织起源 无论高或低分辨率，对卵巢癌、乳腺癌, BRCA, GBMand KIRC的组织起源鉴别准确率95% 对于鳞癌类如HNSC, LUSC、 BLCA，提高分辨率能改进鉴别能力（准确度提升5%以上） 鳞癌类LUSC, HNSC,ESCA 和CESC的CNV相似，易于误分为同一种癌 胃肠道肿瘤如STAD, COAD和READ，也易误分为同一种肿瘤,其它学者的研究：CNV模式与癌症类型,8例肺腺癌CTC，78%呈现一致CNV模式 同一癌症的不同亚型其CNV模式差异（治疗方法启示） 癌症

17、患者治疗前后点突变基因此消彼长，但是CNV模式没有变化,Xiaohui Ni， Minglei Zhuo. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. PNAS , 2013（52）2108321088,肿瘤组织与血浆ctDNA检出CNV的差异,靶向测序能减少成本吗,ctDNA样本检测CNV的困难,外周血ctDNA量太少 采用PCR预先扩增目标基因片段势在必行 每一基因被打碎成100-200bp的片段，却无从得知断裂位置信息 每

18、一基因必须设计众多引物以覆盖目的基因 PCR的扩增不均一性使得CNV计算不准确 CNV多是染色体臂得变化，多个相邻基因同时变化得可信度？ 使用程序算法解决（ ONCOCNV,Valentina Boeva. Multi-factor data normalization enables the detection of copy number aberrations in amplicon sequencing data. BIOINFORMATICS，20414（30）：34433450,Eser Kirkizlar的研究为ctDNA检测肿瘤CNV提供思路,选取分布于5条染色体臂3168个S

19、NPs 目标SNPs至少有10的人口次要等位基因频率（1000） 每个SNP设计多条引物 尽量减少引物二聚体产物形成的可能性 mmPCR-NGS工作流程涉及五个步骤：（1）库准备，（2）mmPCR，（3）条形码和汇集，（4）测序，和（5）序列读取比对 使用Illumina HiSeq 2500测序仪单向测序，BWA-MEM 和samtools mpileup 处理数据， 以hg19人类参考基因组做对照参考 样本构成：明确染色体臂细胞系掺入正常细胞系，包含0%-10%肿瘤ctDNA,Eser Kirkizlar，Bernhard Zimmermann. Detection of Clonal a

20、nd Subclonal Copy-Number Variants in Cell-Free DNA from Patients with Breast Cancer Using a Massively Multiplexed PCR Methodology. Translational Oncology 2015（8）：407-416,随机举例4条染色体臂 实测AAI与理论AAI高度相关 取得0.5%的AAI需要最少1%的ctDNA AAI:等位基因不平衡率,ctDNA在患者外周血的低浓度 一般外周血检出CNV需要ctDNA浓度3.7% - 5.0% 或AAI在 2.2%-3.7% 采用规模

21、SNP特异的PCR扩增后NGS检测CNV ， AAI可低至 0.5%,约需1%的肿瘤ctDNA mmPCR-NGS 只能说明存在CNV异常，无法确定是缺失或增多 mmPCR-NGS需要知晓样本的单倍型（haplotype）信息,Eser Kirkizlar，Bernhard Zimmermann. Detection of Clonal and Subclonal Copy-Number Variants in Cell-Free DNA from Patients with Breast Cancer Using a Massively Multiplexed PCR Methodology. Translational Oncology 2015（8）：407-416,以突变为主的肿瘤特征,点突变与CNV之间存在反相关性 肾细胞肾癌(KIRC),胶质母细胞瘤(GBM), 急性髓细胞性白血病(LAML), 结直肠癌 (COADREAD)、 子宫癌 (UCEC), M1-M8型涉及PI3K-AKT 信号途径 M9M14 涉及APC, TP53 和KRAS 途径,应用多基因组合评估乳腺癌风险时 必须谨慎小心,17 国际顶级专家联合发表文章 在目前认为与乳腺癌相关的 100 多个基因中，仅有21 被确认与遗传性乳腺癌相关。 尽管PTEN 和TP53发生突变也与癌变相关，但