辽宁慢生根瘤菌抗铜基因的克隆及功能分析

1、辽宁慢生根瘤菌抗铜基因的克隆及功能分析土壤的铜污染会给其中微生物造成一定的选择压力, 根瘤菌要保证自身的存活并且与宿主植物形成有效的共生固氮体系, 必须采取一定的保护机制来抵抗高铜浓度造成的胁迫。分离自陕西宁强代家坝铜锌矿中的辽宁慢生根瘤菌Bradyrhizobium liaoningense CCNWSX0360对铜的最大耐受浓度为2.0 mM。本文利用转座子 Tn5-pRL1063a 对 B.liaoningense CCNWSX0360 进行随机突变 , 建立了库容为 17247 的突变体库。铜敏感性筛选获得6 株突变株 Bln-d 、Bln-163 、Bln-c 、Bln-29 、Bl

2、n-32 和 Bln-54 。采用质粒挽救法确定Tn5 的插入位点 , 结果显示 Bln-d 和 Bln-163 中 Tn5 插入到同一个基因的不同位置, 相似性比对鉴定为编码重金属转运P1B-typeATPase的基因 , 命名为 cueA, 其余 4 个突变体中 Tn5 分别插入到基因 copA( 编码多铜氧化酶 ) 、ctpA( 编码羧基末端处理酶 ) 、tolC( 编码 TolC 家族蛋白 ) 和 lptE( 编码脂多糖转运分子伴侣 ) 内部。重金属耐受性分析结果显示:Bln-d 、Bln-163 、Bln-c 专一对铜敏感 , 说明 cueA 和 cop A 特异地介导菌株对铜的抗性

3、, 在保护细菌免受铜的毒害中起关键作用; 除 Cu以外 ,Bln-32 、Bln-54 和 Bln-29 不同程度地对其它重金属敏感 , 说明 ctpA 、tolC 和 lptE 通过间接途径赋予根瘤菌铜抗性。根据上述基因的功能注释得出: 在 B.liaoningense CCNWSX0360 中至少存在3 种抗铜机制 : 跨膜转运机制 (cueA 和 tolC) 、氧化 / 还原机制 (copA) 和膜屏障保护机制 (ctpA 和 lptE),共同赋予细菌抵抗铜胁迫的能力。 根据跨膜金属结合基序及标签序列信息本研究将cueA 编码的蛋白 CueA归为 Cu+/Ag+转运 P1B-typeAT

4、Pase。CueA的 N端的金属结合基序为两段His-rich区, 而不是典型的 GXXCXXC基序。利用同源重组构建了突变体csoR 和cueA, 铜耐受性测试结果显示 :cueA 和 cueA:Tn5 的铜敏感程度相同 , 对铜的最大耐受浓度 (MTC)为 0.8mM,显著低于野生型 ; 互补 cueA 基因能够回复突变体到野生型菌株的抗性水平。qRT-PCR和 lacZ 融合表达分析结果表明:Cu2+显著诱导 cueA 的表达且表达水平依赖于 Cu2+的浓度 ; 一价铜离子螯合剂BCS能够消除 ( 减小 )Cu2+对 cueA 的诱导和对细菌的毒害。结合铜耐受性测试、qRT-PCR以及

5、lacZ 融合表达分析结果证实了 cueA 通过向细胞周质空间转运一价Cu+来维持根瘤菌的铜抗性。运用 qRT-PCR和 lacZ 融合表达分析技术检测了野生型、突变体csoR 以及互补菌株csoR(csoR) 中 csoR 和 cueA 的表达水平 , 结果表明 : 缺失 csoR 引起基因 cueA 和 csoR 高水平组成型表达 ; 互补 csoR 恢复依赖 Cu2+的诱导表达 , 证明了CsoR利用去阻遏机制负调节csoR 和 cueA。实验结果还表明 : 突变 csoR 显著增加了菌株对 Cu、Zn 和 Cd的抗性 , 并且这 3 种金属离子均能诱导基因csoR 和 cueA的表达

6、; 在 Escherichia coli GG48中表达 CueA能够提高该菌对 Zn 和 Cd抗性 ,说明 cueA 不仅能够介导 Cu+而且介导 Zn2+和 Cd2+的抗性。此外 ,N 端截短实验发现 : 缺失 N端的 His-rich区丧失 CueA的部分铜抗性功能 , 完全丧失在 CueA的 Zn/Cd 抗性功能 , 表明 N 端的 His-rich区在 CueA的抗铜功能中发挥重要作用但不是必须的, 而在抗 Zn和 Cd的功能中是绝对需要的 , 具体作用还不清楚 , 可能通过金属离子结合位点来缓冲细胞内的金属离子浓度。通过共接菌实验比较野生菌和突变体?cueA的竞争结瘤能力 , 得出

7、根瘤菌的铜抗性能够赋予其在铜胁迫下的结瘤能力。基因突变以及铜耐受性分析结果显示:cop 操纵子中 6 个基因均专一对铜敏感 , 其中 copA 和 copB 是整个系统的核心组分 , 二者需要同时存在才能发挥作用;新基因 2212 和 2213 能够赋予 cop 操纵子的完全的铜抗性 ;copC 和 cus F 则对菌株的耐受性贡献不大 , 推测这 6 个基因编码的蛋白可能相互作用形成介导铜抗性的符合体。这 6 个基因在不同铜浓度胁迫下具有相同的表达趋势, 即在较低 Cu2+浓度下 , 随着 Cu2+浓度的升高各个基因的转录水平逐渐增加, 在 0.625 mM Cu2+浓度下表达量均达到最大, 在高浓度下则转录水平下降。综合共转录验证实验及5RACE实验得出这 6 个基因为一个转录单元 , 受同一个启动子启动转录 , 转录起始点为基因 2213 起始密码子上游第26 个碱基“G”。启动子活性分析以及lacZ 融合表达分析结果表明2213 与 2212 之间的间隔序列在调节操纵子的表达起着关键作用, 但具体调控机制还未研究不清楚。生