鸦胆子提取物鸦胆子苦素E(BruceineE)的抗HIV-1活性及机制研究

1、鸦胆子提取物鸦胆子苦素E（BruceineE）的抗 HIV-1 活性及机制研究背景 :HIV/AIDS 是严重威胁人类健康全球流行性疾病, 目前仍无有效的预防性疫苗及根治性药物问世。治疗的主要困难在于,HIV-1 所具有的高复制特性及高突变特性 , 使 HIV-1 很快产生耐药突变 , 并突破耐药基因屏障 , 形成耐药准种而致治疗失败。在发明有效的疫苗之前 , 寻找到更有效的药物与治疗靶点, 是抗 HIV-1 感染的主要目标之一。天然产物小分子为新药的开发提供了丰富多样的来源及结构前体。传统中草药是中华民族几千年来的经验与智慧总结, 是现代药物研究的重要来源与宝贵资源。用现代手段提取的中草药化

2、合物小分子, 在抗感染、肿瘤治疗等方面取得了丰硕的成果。本研究拟从鸦胆子果实中提取分离苦木内酯类化合物, 并结合前期进行的抗HIV-1 初筛结果 , 对发现的具有抑制HIV-1 活性的鸦胆子苦素E, 进一步展开细胞毒性、抗 HIV 的活性及其机制的研究。 第一部分鸦胆子苦素E 的分离、提纯及细胞毒性检测目的 : 从植物鸦胆子的干燥果实中分离提取鸦胆子苦素E, 并对其进行细胞毒性检测。方法 : 首先将干燥鸦胆子果实经乙醇浸泡, 浸出液制成无乙醇浸膏 , 再经过萃取 , 分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分。对乙酸乙酯部分再经过硅胶柱层析色谱、制备型薄层色谱、 MCI柱层析、 Sephad

3、ex LH-20 凝胶柱色谱、半制备型 HPLC等进行化学成分的分离。最后 , 利用 ESI-MS,UV,IR,1 H-NMR,13C-NMR,DEPT,HSQC,HMBC,NOESY等波普对单体化合物进行结构鉴定。应用MT2细胞和 TZM-bl 细胞 , 通过形态学、 MTT法分别检测该化合物细胞毒性, 计算该化合物的半数细胞毒性浓度(CC50), 获得药物的安全范围。结果 : 共分离并鉴定得到11 个单体化合物 , 均为苦木内酯类 : 鸦胆苦醇、鸦胆亭醇、鸦胆子苦素M、鸦胆子苦素 D、鸦胆子苦素 J、鸦胆亭、鸦胆子苦烯、鸦胆苦内酯 S、鸦胆子苦素 E、鸦胆甙 A、鸦胆苦甙 A。对其中的化合

4、物鸦胆子苦素E(Brucine E)用 MT2细胞进行进行的检测结果显示该化合物细胞毒性较低, 化合物作用 72h, 对 MT2细胞的 CC50为 1312M(95%CI:1157-1487M), 对 TZM-bl 细胞的 CC50为 988.1 M(95%CI:886.6-1101 M)。结论 : 乙酰乙酯萃取部分分离鉴定出11 个苦木内酯类化合物 , 其中 BrucineE 细胞毒性较低 , 具有较高的浓度安全范围。第二部分鸦胆子苦素E 的抗 HIV-1活性目的 : 评价鸦胆子苦素E(Brucine E)的抗 HIV-1 活性。方法 : 通过 HIV-1 致 MT2细胞合胞体形成的作用 ,

5、 评价受试化合物的抗HIV-1活性 ; 通过 TZM-bl 细胞 -HIV-1IIIB感染模型的 Luciferaseassay, 评价该化合物对 HIV-1 感染的抑制活性 , 并计算其半数抑制量IC50; 以 MT2细胞 -HIV-1IIIB感染模型 , 通过检测培养上清p24 与细胞 HIV-1 RNA, 评价该化合物抗HIV-1 活性 ,以 p24 抑制率计算其抑制活性 IC50 的化合物浓度 ; 通过公式 CC50/IC50 计算该化合物的治疗指数 TI50 。结果 : 形态学结果显示 , 药物浓度 >80 M时 ,bruceine能完全抑制合胞体的形成;TZM-bl 荧光检测

6、显示 , 该化合物半数抑制浓度IC50 为79.76 M(95%可信区间 :61.37 to 103.7 M), 治疗指数 (therapic index,TI)为13.39(TI=988.1/79.76);MT2细胞 -HIV-1IIIB感染模型 , 结果显示 , 该化和物对p24 的抑制浓度 IC50 为 34.55 M(95%可信区间 :30.48 to 39.17M), 治疗指数(therapic index,TI)为 19.43(TI=1312/37.97)。结论 : 该化合物具有抑制病毒所致合胞体形成的作用及抑制HIV-1 复制的活性。第三部分 Brucine E抑制 HIV-1

7、复制的作用环节研究目的: 深入了解该化合物抑制 HIV-1 复制的作用环节。方法 : 用 TOA实验判断化合物的作用环节; 进一步用感染前抑制实验, 判断该化合物对进入环节的影响; 用急性感染模型TZM-bl 细胞判断其对急性感染的整合前环节的影响 ; 用 MT2稳定感染细胞判断该化合物对病毒复制整合后事件的影响 ; 用逆转录酶、蛋白酶的活性抑制实验 , 判断该化合物对病毒复制关键酶的影响。结果 :TOA实验结果表明 , 该化合物在病毒复制的早期及晚期阶段均能发挥抑制作用。该化合物对病毒的进入环节并不产生影响 ;TZM-bl 细胞的 Luciferase assay实验也证实该化合物对病毒复制

8、的早期事件具有抑制作用。逆转录酶和蛋白酶的活性抑制实验结果表明 ,Bruceine E对该酶的抑制活性IC50 为 116.8 M(95%IC50:93.88 to 145.2),对蛋白酶的抑制活性在160M时的抑制率为21.64%(对照组 lopinavire为 30.13%)。晚期抑制效应通过稳定感染抑制实验进一步证实。结论 :BruceineE对 HIV-1复制的早期和晚期阶段均产生抑制效应, 其机制与对逆转录酶和蛋白酶的抑制活性有关。第四部分 :Bruceine E对 HIV-1 复制相关的细胞基因表达影响目的: 评价bruceine E对 HIV-1 复制相关的细胞基因表达的影响。方

9、法: 用 PCR array 法检测与 HIV 复制有关的 84 种细胞基因在 bruceine E处理前后的差异化表达。结果 :8 个基因上调表达 :APOBEC3F、 APOBEC3G、CDK7、CXCR4、 GADD45A、HTATSF1、IFNG、NFKBIA,以 GADD45A和 IFNG表达差异最大 , 上调表达超过5 倍。17 个基因表达下调 :APEX1、BCL11B、 CASP3、CASP8、CCL2、CCL4、CCL5、CD4、CR2、EP300、FOS、HMGA1、STAT1、STAT3、TNF、TNFSF10、TRIM5,有 7 个基因表达表达下调超过80%,其中又以 CCL4、CCL5、CR2基因的表达下降最显著 , 表达下降均超过 90%。其中与病毒复制最相关的是抗HIV 天然免疫因子 APOBEC,在与病毒进