时间分辨培训ppt课件

1、时间分辨荧光免疫分析技术培 训,1,问 题,时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。 TRF的标记物及特点。 为什么叫“时间分辨”? TRF在免疫分析方法学中的地位。 各种免疫方法学的比较。,2,标记免疫学发展历程,放射免疫（精度：10-12mol/L ） 酶联免疫（精度：10-9 mol/L ） 化学发光（精度：10-15mol/L ） 电化学发光（精度：10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ） 生物芯片 （未知）,3,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs (药物浓

2、度),Thyroid Hormone (甲状腺激素),Fertility Hormone (孕激素),Cancer Markers (肿瘤标记物),Infectious Disease (传染病),Vitamins (维生素),Serum Proteins (血清蛋白),10-12,10-9,10-6,10-3,10-0,4,各种免疫方法学的比较,5,放射性免疫分析法（RIA）,应用 放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。 夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。,缺点 放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家

3、逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室） 125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。 标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。 操作繁琐，出报告时间长。 无法保存备用。,6,酶免疫分析法（ELISA ）,应用 酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。 试剂有效期较长。 衍生技术： 荧光酶免疫分析 增强化学发光酶免疫技术 曾经一度被认为是取代放免的检测手段。,缺点 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。 因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。,7,化学发光免疫分析法（CLIA）,应 用 单个样本检测速度快，适

4、合做急诊。 灵敏度较高。 自动化程度高。 仪器种类： 拜耳 ACS180 系列 雅培 AXSYM 贝克曼 ACCESS 德普 IMMULITE,缺 点 样品不能重复检测；出现故障则整批试剂及血样报废。 本底较高，易受环境物质干扰。 仪器故障率较高。 标准曲线稳定性较差，需多次定标。 检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。 非开放性试剂；试剂价格高。,8,电化学发光免疫分析（ECL）,应用 80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。 基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。 本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。,缺点 仪器检测速度慢 （罗

5、氏公司） ECL1010 60 测试/小时 ECL2010 90 测试/小时 非开放性试剂系统、不能做科研。 试剂价格过高。,9,时间分辨荧光免疫 （TRFIA）（Time-Resoled Fluoroimmunoassay）,10,时间分辨荧光免疫的基本原理,用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质； 当免疫过程结束后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的物理特点 （特异性强、 Stokes位移大、 寿命长），并采用解离-增强技术（ DELFIA）放大有效荧光；最后用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。 根据已知浓度

6、所确定的标准曲线，来判断未知样品的浓度值，以达到定量分析的目的。,11,时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）,12,标记物为具有独特荧光特性的稀土金属-镧系元素,镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种： 铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te) 镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长 镧系元素螯合物（60900 us) 普通荧光免疫中荧光团：1100ns 样本中蛋白质荧光：110ns，易猝灭。 Stokes位移大（大约290nm） 铕：发射光613nm、激发光340nm， 荧光素的Stokes位移为28nm 荧光

7、特异性强。（发射光谱带很窄：615 5nm） 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,13,通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光 分辨开来，使本底达到0,利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光。而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0,14,利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障,发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。,15,光 路 图 简 介,氙灯,紫外滤光透镜,分束器,样品杯,滤光片,PMT,负反馈,16,DELFIA技术为临床检测带来的先进性,17,不 同 标 记 物

8、的 波 长,18,0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L,5,100,2000,Cps.10 3,时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定， 同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标,DELFIA hFSH,标准曲线稳定，试剂保质期长,N=6,19,时间分辨荧光免疫的试剂种类,甲状腺功能检测 TSH，Ultra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG 性激素类检测 FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG 肿瘤标记检测 AFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Tot

9、al），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199 遗传科检查 产前筛查： hAFP/ HCG ，PAPPA 新生儿筛查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKU 传染病检测 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 血液科检测 贫血检查：Ferritin，Vit B12，Folic acid 科研工具 单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测,20,时间分辨荧光免疫-突出优点,零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化,TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免

10、疫学带来一场革命。,21,新波生物徽标,六边形模块 - 象征生物科技 细胞形内核 - 象征企业内涵 多元化组织 - 象征新波个体,共同发展 有机合作 多元个体相互促进,子公司： 上海美生生物技术有限公司 苏州新波生物技术有限公司 广州新波生物技术有限公司 陕西新波生物技术有限公司 青岛新波生物技术有限公司 经销商： ,22,公司简介,上海新波生物技术有限公司是一家新近成立于上海浦东张江高科技开发区的高新技术企业，是国际上少数几家掌握“时间分辨荧光免疫”检测技术的厂家之一。 新波生物致力于这一新技术的研究，现已在方法学研究、试剂合成、标记物的制备、抗原抗体纯化、检测仪器的生产等方面均取得了很大成

11、果。 2000年在国内首家推出了ANYTEST2000型时间分辨荧光免疫检测系统，并列为上海市高新技术项目；与此仪器配套的试剂种类多达82种，其中58项用于临床检验、24项用于科研。,23,仪器种类（DELFIA）,全自动 AutoDELFIA 1235 （WALLAC） 半自动 VICTOR2 1420 （WALLAC） 半自动 ANYTEST2000 （上海新波） 半自动 DELFIA 1234/1232 （WALLAC 停产）,24,全自动 AutoDELFIA 1235,25,26,自动的操作界面,27,简洁的参数设置,28,清晰的试剂图示,29,快速的检测过程,6个项目、480个测试

12、,30,半自动 VICTOR2 1420,31,VICTOR2 1420 操作界面,32,半自动 ANYTEST2000,33,Anytest2000 时间分辨检测仪,34,ANYTEST2000 主要特点,试剂的多样性 种类多达82种，其中临床58项、科研24项 每年推出新诊断试剂盒（根据客户不同需求而开发） 仪器的先进性 高灵敏度： 10 -18 mol/L（Eu 3+） 线性范围宽： 10 -13 mol/L 10 -18 mol/L 高稳定性： 1 % 快速测试： 1秒样 标本量灵活： 适合每天1400份标本量 适用范围： 各类大小型的医院、生化实验室 应用于临床检测和科学试验 标准曲

13、线、测试数据长期保存、共享 智能化操作软件 价格的可比性 进口试剂国内分装价格与进口酶标试剂可比性 专为中国设计的仪器价格与进口计数仪的可比性,35,ANYTEST2000智能化操作界面,友好的主界面 简洁的操作过程 强大的数据处理,36,振荡器及洗板机,Egate2310全自动洗扳机 2510变频振荡器,37,Egate2310 全自动洗涤机功能特点,操作界面简洁明了 内置16种洗涤程序（用户可编辑） 洗涤程序可长期保存 两种自动清洗模式（WASH、RINSE） 消毒功能（DISINFECTION） 300uL洗液标准量的校准 机械位置随意调整，适合各种规格微孔板、条的洗涤,38,2510

14、变频振荡器的功能特点,均匀旋转式振动，使得微孔内的免疫反应可以在孔内壁上均匀进行。 采用变频设计，使得振荡频率不受负载变化影响；避免了因负载发生改变导致频率漂移的状态发生。,39,乙肝表面抗原免疫反应图 （时间分辨荧光法）,40,乙肝表面抗体免疫反应图 （时间分辨荧光法）,41,乙肝抗原免疫反应图 （时间分辨荧光法）,42,乙肝抗体免疫反应图 （时间分辨荧光法）,43,乙肝核心抗体免疫反应图 （时间分辨荧光法）,44,新技术的挑战,放免其必然受到一代新的更灵敏、稳定、快速，而且全自动化的测量技术的挑战。但取代它的决不是发色酶标，因其技术指数尚不及放免。 从90年代开始放免分析在国际上每年以 1

15、015% 的速度下降，这是事实。一些大型的实验室，标本量大的项目都已逐步应用各种非放免标记的自动化设备来进行分析，这是技术发展的必然规律。 我们必须清醒地分析趋势，迎接新技术的挑战和带来新的曙光。,45,时间分辨法检测“乙肝五项”的意义,原子标记、灵敏度高，有效区分弱阳性与阴性血样。 二步法的采用，最大限度避免HOKE现象出现。（强阳性血样检测为阴性） 定量检测可以动态观察治疗效果。 量化评估乙肝疫苗接种效果。 结果准确、价格适中。,46,NCU/ml单位来源,National Center for Clinical Laboratory,(NCCL) 国家卫生部临检中心,NC UNIT NCU/ml,47,我们的目标,为使我国的临床检验工作达到国际先进水平，我们将不懈努力，积极普及先进的时间分辨荧光免疫分析技术，不断推出新产品，以取代放免、酶标。