在线二维液相色谱法快速测定桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量

1、在线二维液相色谱法快速测定桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量高效液相色谱已成为中药复杂体系研究的重要技术， 随着新 型色谱柱填料和键合技术的发展， 为中药中各类成分的分离提供 了多种选择，然而中药的复杂性已远远超出了人们的设想， Davis 等1 曾经指出用一维分离方法对含有 100 个随机组分的样品进 行分离，完全分离 82个组分，至少需要 400 万的理论板数，且 当色谱峰的数量超过峰容量的 37%时，系统的分离度会大大降低， 所以在现有技术条件下， 期望如此高的柱效和峰容量是不切实际 的。多维液相色谱分离是液相色谱发展的一个重要方向， 它是将 多种不同分离机制的色谱体系

2、进行联用， 增加了色谱系统的分离 能力，扩大了分离空间，提高了系统的峰容量，可以满足复杂样 品的分离要求。在多维色谱分离手段中，二维分离最为常见。二 维色谱根据一维组分是否直接进入到第二维进行分离可分为离 线2-4 和在线 5-62 类，其中在线方法具有自动化程度高、避 免人为误差及加快样品分析效率等优点， 二维液相色谱分离技术 已被越来越多的应用到中药的研究中 7-9 。桂枝茯苓胶囊系汉代张仲景 金匮要略 古方桂枝茯苓丸的 改进剂型，经现代制造工艺精制而成为纯中药制剂，由桂枝、牡 丹皮、桃仁、赤芍和茯苓组成。在 2010 年版中国药典中收 载的桂枝茯苓胶囊含量测定项下分别采用 3 种高效液相

3、色谱法测定丹皮酚、 芍药苷和苦杏仁苷的含量 10 ，不仅实际样品的分 析效率较低， 且缺乏来自桂枝中的指标性成分。 本文利用双梯度 高效液相系统（ dual gradient liquid chromatography， DGLC）在线二维色谱分离技术，样品提取后，溶液直接进样分析，并同 时测定了肉桂酸的含量， 含量测定结果与原方法基本一致， 且样 品分析效率大大提升，可用于桂枝茯苓胶囊的质量分析。1 材料双三元液相色谱RS系统（美国赛默飞世尔公司），配置 6 通道真空脱气机SRD36O0双梯度分析型色谱泵 DGP3600RS自 动进样器 WPS3000TSL柱温箱TCC-3000 （配有1个

4、六通阀和1 个十通阀），二极管阵列检测器DAD3000RS变色龙色谱管理软件 Chromeleon 6.8 SR11; Acclaim PAH （4.6 mnh 150 mm 3 卩 m, 美国赛默飞世尔公司， 批号063191） ; Acclaim C18色谱柱（3.0 mm98%， 上海安谱，STA-07013001）;苦杏仁苷（amygdaloside，纯度 99% 上海安谱，STA-20107007）;肉桂酸 （cinnamic acid ,纯度 99% 上海安谱，STA-43200000）。桂枝茯苓胶囊（江苏康缘药业XX公司，产品批号 110625， 110626， 110730）。

5、2 方法和结果2.1 色谱条件 一维分析泵的流动相 A 为乙腈，流动相 B 为 0.08%磷酸+0.08%三乙胺， Acclaim 120 C18 为一维分析柱，流 速为 0.5 mL?min-1,梯度洗脱，010 min, 15%A 1025 min, 15%75%A 2530 min, 75%85%A 3033 min, 85%A 33 35 min , 85%15%A二维分析泵的流动相 A为乙腈，流动相 B 为 20 mmol, pH 3.0 的磷酸二氢钾，Acclaim PA II C18 为二维分 析柱,梯度洗脱程序, 0 5 min , 5%A, 5 15 min , 5% 40%

6、A, 1515.2 min , 40%5%A, 15.220 min , 5%A, 2030 min , 5%70%A 3035 min, 70%A 流速 0.8 mL?min-1,柱温 35 C, 检测波长 0 10 min，230 nm，10 15 min，218 nm，15 35 min， 275 nm,进样量 5 L。2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取肉桂酸、芍药苷、苦 杏仁苷和丹皮酚对照品适量，按照 2010 年版中国药典桂枝 茯苓胶囊项下对照品溶液制备方法， 制得各对照品质量浓度分别 为 0.63，1.11 ，0.66，1.32 g?L-1 。2.3 样品溶液的制备 取桂枝茯苓

7、胶囊 10 粒，将内容物至研钵中研匀，取细粉约 0.25 g ，精密称定，置具塞的锥形瓶中，加入50%甲醇 25 mL，密塞，称定质量，超声提取 30 min ，放冷，再称定质量，补足 失重，摇匀，滤过，取续滤液适量，即得。2.4 专属性试验 分别取缺少桂枝、桃仁、白芍和牡丹皮的 阴性制剂， 按照 2.3 项下方法制备阴性样品。 按照上述色谱条件进样分析，对照品、样品、阴性样品的分离谱图见图13。从阴性样品叠加谱图可以看出， 不干扰目标物的测定， 方法专属性 较好。其中，010 min为一维色谱分离过程， 波长230 nm 10 15 min 为二维色谱分离过程，波长 218 nm；1525

8、min 为一维 色谱分离过程，波长 275 nm；25 35 min 为二维色谱分离过程， 波长为 275 nm。2.5线性关系考察 分别取各对照品溶液2 mL （肉桂酸对照 品200卩L）至10 mL量瓶中，加50卿醇至刻度，作为混合对 照溶液 1，再分别从对照品溶液 1 中精密量取 5.0， 2.5， 1.0， 0.5 , 0.25 mL至10 mL量瓶中，加50卿醇稀释至刻度，摇匀， 制成系列混合对照品溶液。 按照 2.1 项下色谱条件进样分析， 以 峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，肉桂酸、 芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚分别在 0.31512.6， 5.55222.0， 3.

9、3132， 6.6264 mg?L-1 线性关系良好， r 分别为 0.999 7 ， 0.999 7 ， 0.999 8 ， 0.999 5 。2.6 精密度试验 取混合对照品溶液连续进样 5 次，结果表明，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.33%， 0.51%， 0.39%， 0.64%。2.7 稳定性试验 取待测样品溶液，分别于配制后 0， 2， 4，6， 10， 12 h 进样，测定待测成分的峰面积，结果表明，肉桂酸、 芍药苷、苦杏仁苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为1.4%, 0.45%,1.1%， 0.46%。2.8 重复性试验 取同一批号的桂枝茯苓胶囊样品粉末

10、5 份， 每份 0.25 g ，精密称定。按照样品溶液制备方法制备样品，按 照上述色谱条件进行测定，结果表明，肉桂酸、芍药苷、苦杏仁 苷和丹皮酚含量的 RSD分别为0.39%, 0.65%, 0.68%, 0.78%。2.9 加样回收率试验 取已知含量的样品 6份，每份 0.1 g ， 精密称定,置锥形瓶中,加入芍药苷、苦杏仁苷、丹皮酚和肉桂 酸对照品溶液适量, 按照供试品溶液制备方法制备样品并测定含 量,计算回收率,结果见表 1。2.10 含量测定 取批号为 110730, 110625, 110626的桂枝 茯苓胶囊 0.25 g ,精密称定,按照样品前处理方法制备样品溶 液,分别采用本法

11、与药典方法测定,结果见表 2。3 讨论3.1 分析流路构建 样品中芍药苷与丹皮酚的含量较高,样 品基质成分干扰较少, 利用一维色谱进行分离, 而苦杏仁苷与肉 桂酸的含量较低, 受到基质成分干扰影响较大, 因此采用中心切 割的二维分离方法,将 2 种成分分别切至二维色谱中进行分离。 为避免在切换转移过程中系统压力的骤然变化对色谱柱造成的 影响,试验中采用定量环储存样品。 为减少一维溶剂效应的影响, 试验中米用300卩L的定量环，并尽量减小一维色谱柱的柱体积。 同时在一维和二维色谱柱的柱后通过 1 个六通阀实现了检测器 的共用,使方法更具普适性。 整个系统流路和阀切换过程见图 4, 表 3。3.2

12、 色谱条件确定 本文为实现一维和二维分离选择的正交性，在色谱柱选择上先后尝试了 PFP+C18 PFP+P/SC18, C18+P如C18等组合，最终确定 C18+P如C18组合（柱选择性对 比函数FS=6111）。可获得良好的峰形和分离度；在流动相选 择上，试验中曾尝试在一维和二维分离中的有机相分别采用甲醇 和乙腈，但由于苦杏仁苷与肉桂酸的色谱峰在一维分离过程中峰 宽较大， 切割过程中可能会造成损失， 若一维分离的有机相也采 用乙腈， 则 2 种成分的峰宽较小， 且与二维色谱流动相相溶性较 好。在水相选择上， 本文为使芍药苷和丹皮酚在一维分离过程中 获得良好的峰形和分离度，选择了 0.08%

13、磷酸系统，并加入了 0.08%的三乙胺，而二维水相中加入磷酸缓冲盐，可以减少一维 溶剂pH变化对二维分离造成的影响。3.3 含量测定结果比较 比较样品的含量测定结果发现，芍 药苷、丹皮酚的含量基本一致，但苦杏仁苷的含量差异较大（本 法较药典方法低近 5%）。本文首先对比了采用药典方法和本法 的样品谱图中苦杏仁苷色谱峰的 UV光谱均匀性，结果二者基本 一致，且光谱均匀性均较好，无法通过UV二极管阵列检测器来判断方法的专属性。 因此本文采用二维分离手段， 在常规药典方 法基础上， 将苦杏仁苷峰的主体中心切割至第二维色谱柱中进行 分离，结果见图 5，由于一维和二维色谱柱存在分离选择性的差 异，结果在同样检测波长下， 在二维分离的谱图中可见明显杂质 峰（ tR=16.953 min） ，说明常规药典的分离手段存在基质干扰