动物细胞工程教学PPT

1、动物细胞工程 动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞融合动物细胞融合 单克隆抗体制备单克隆抗体制备 动物体细胞动物体细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物 思考与回忆： 1 1、动物细胞全能性特点？、动物细胞全能性特点？ 随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜 能变窄。细胞核仍具有全能性。能变窄。细胞核仍具有全能性。 2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育 成动物个体？成动物个体？ 不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一 定的组织分化，不管采用什

2、么手段和培养条件，由于细定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细 胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间 的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单 的细胞培养。的细胞培养。 3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？、动物的细胞培养的理论依据（原理）？ 细胞增殖细胞增殖 动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞融合动物细胞融合 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 核移植核移植 动物动物 细胞细胞 工程工程 常用常用 技术技术 其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础 本节内容：本节内容

3、： 一、动物细胞培养的应用和概念：一、动物细胞培养的应用和概念： 1 1、概念：、概念：动物细动物细 胞培养就是从动物胞培养就是从动物 有机体中取出相关有机体中取出相关 的的组织组织, ,将它分散将它分散 成成单个细胞单个细胞, ,然后然后, , 放在适宜的放在适宜的培养基培养基 中中, ,让这些让这些细胞生细胞生 长和增殖长和增殖. . 2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖 定义：定义：人们通常将人们通常将 动物组织动物组织消化后消化后的的 初次培养初次培养称为原代称为原代 培养。培养。 胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理 取出组织取出组织 胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织 剪碎剪碎 单个细

4、胞单个细胞 细胞悬液细胞悬液 转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长贴壁生长长成单层细长成单层细 胞。有胞。有接触抑制接触抑制现象）现象）。 原代培养原代培养 3 3：过程：过程图示图示 原代培养原代培养 强调一：细胞贴壁过程强调一：细胞贴壁过程 细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就在培养瓶悬液中分散的细胞很快就 贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易表面光滑、无毒、易 于帖附。于帖附。 当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生 长到表面相互接触时长到表面相互接触时, , 细胞就会停止分裂增细胞就会

5、停止分裂增 殖，这种现象称为细殖，这种现象称为细 胞的接触抑制。胞的接触抑制。 强调二：接触抑制强调二：接触抑制 强调：细胞系、细胞株（强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系了解即可，老课本体系） 细胞细胞 悬浮悬浮 液液 1010代代 细胞细胞 5050代代 细胞细胞 无限无限 传代传代 原代培养原代培养 传代培养传代培养 细胞株细胞株 细胞系细胞系 如何界定原代培养和传代培养；细胞株如何界定原代培养和传代培养；细胞株 和细胞系？和细胞系？ 多数组织细胞固定在表面多数组织细胞固定在表面 生长和分裂。生长和分裂。 随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖 遗传物质改

6、变遗传物质改变 几个有关概念：几个有关概念： 原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞从机体取出后立即培养的细胞 为原代细胞。培养的为原代细胞。培养的第第1 1代代细胞与细胞与传传1010代以代以 内内的细胞称为原代细胞培养。的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，将原代细胞从培养瓶中取出， 配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以 上的培养瓶中继续培养，称为传代培养上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。 细胞株：细胞株：原代细胞一般传至原代细胞一般传至1010代左右细胞生长代左右细胞生长 停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存

7、活到停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到 40504050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至5050代后又出现细胞生长代后又出现细胞生长 停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变， 使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代 细胞为细胞系。细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别：细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质细胞系的遗传物质 改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容 易传代培养。易传代培养。 3 3、总结

8、：动物细胞、总结：动物细胞 培养过程培养过程 动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物 的组织、器官的组织、器官 配置细胞悬液配置细胞悬液 剪碎用胰蛋白酶处理剪碎用胰蛋白酶处理 1010代细胞代细胞 转入培养瓶转入培养瓶 40-5040-50代细胞代细胞 传传 代代 培培 养养 无限传代无限传代 单个细胞单个细胞 加培养液稀释加培养液稀释 传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改变，遗传物质不改变， 保持保持正常正常二倍体核型二倍体核型。 传代传代10-5010-50代左右，增长缓慢以至代左右，增长缓慢以至 于完全停止，于完全停止，部分细胞核型可能发部分细胞核型可能发 生变化生变化（遗传物质可

9、能改变（遗传物质可能改变） 为什么用胰蛋白酶处理？为什么用胰蛋白酶处理？ 分瓶分瓶传代培养传代培养 原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、细胞贴壁、 接触抑制接触抑制 继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不获得不 死性死性，细胞突变细胞突变，遗传物质已经遗传物质已经 改变改变，等同于癌细胞等同于癌细胞。 细胞株：细胞株：一般说一般说 遗传物质未改变遗传物质未改变 细胞系：细胞系： 遗传物遗传物 质已改质已改 变变 原原 代代 培培 养养 4.4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件: : 1 1）无菌无毒）无菌无毒 的环境：的环境： 适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度

10、为人和哺乳动物细胞最适温度为 36.536.50.50.5。 适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：phph：7.2-7.47.2-7.4 液体合成培养基：（液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长糖、氨基酸）、促生长 因子、（水、无机盐、微量元素）因子、（水、无机盐、微量元素）等；通等；通 常还需加入常还需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。 4 4）气体环境：）气体环境： 2 2）营养：）营养： 3 3）温度和）温度和phph： “ “9595空气空气+5+5coco2 2” ”的混合气体培养箱。的混合气体培养箱。 氧氧气是细胞代谢必须的；气是细胞代谢必须的； coco2 2维持培养维持培

11、养 液的液的phph。 对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液 中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更 换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止对培养细胞 造成危害。造成危害。 问题问题3 3：为什么用胰蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白酶处理？ 问题问题1 1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细 胞培养材料？胞培养材料？ 因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。 问题问题2 2、

12、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？ 扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。 动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰胰 蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和 细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？ 动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适ph值为值为7.

13、2-7.4，胰蛋白酶作用的适，胰蛋白酶作用的适 宜宜ph为为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜，胃蛋白酶适宜ph为为2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在ph为为 7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。的动物细胞培养中无活性。 问题问题5 5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？ 控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。 问题问题6 6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物 组培培养基有何独特之处？组培培养基有何独特之处？ 问题问题7 7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最、动物细

14、胞培养能否像绿色植物组织培养那样最 终培养成新个体？终培养成新个体？ 主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维 生素和动物血清等。独特之处有：生素和动物血清等。独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、 成分中有动物血清等成分中有动物血清等 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发 育成新的动物个体育成新的动物个体 问题问题8 8、动物细胞培养的原理：、动物细胞培养的原理： 细胞增殖。细胞增殖。 问题问题9 9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通

15、常在1010代代 以内，为什么？以内，为什么？ 1010代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。 5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用: : 1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞 3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细

16、胞培养的比较：植物组织培养和动物细胞培养的比较： 比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养 原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖 培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基 培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素 葡萄糖葡萄糖 促促- - - - 动物血清动物血清 培养结果培养结果植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系 培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育 无病毒植株无病毒植株 获得细胞或细胞获得细胞或细胞 分泌蛋白分泌蛋白 取材取材植物幼嫩部分或植物幼嫩部分或 花药花药 胚胎或幼龄动物胚胎或幼龄动物 的器官或组织

17、的器官或组织 其他条件其他条件无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜 条件条件 无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜 条件条件 获得获得杂种植株杂种植株用途用途 物理、化学方物理、化学方 法法（同左）（同左） 生物：灭活的病毒生物：灭活的病毒 物理（离心、物理（离心、 振荡、电刺激）振荡、电刺激） 化学（化学（pegpeg） 诱导方法诱导方法 使细胞使细胞分散后分散后 诱诱导细胞融合导细胞融合 去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱 导导原生质体融合原生质体融合 细胞融合细胞融合 的方法的方法 细胞膜的细胞膜的 流动性流动性 细胞膜的细胞膜的流动性流动性 植物细胞植物细胞全能性全能性 原理原理 动物细胞融合动物细胞融合

18、植物体细胞杂交植物体细胞杂交 比较项目比较项目 植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较 主要用于制备主要用于制备 单克隆抗体单克隆抗体 二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1、定义：定义： 动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞一个细胞 的细胞核的细胞核, ,移入一个已经移入一个已经去掉细胞核的卵母去掉细胞核的卵母 细胞中细胞中. .使其重组并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎, ,这这 个新的胚胎最终发育为个新的胚胎最终发育为动物个体动物个体. . 3、分类：分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体

19、细胞核移植。 胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程 度低，恢复其全度低，恢复其全 能性相对容易。能性相对容易。 动物体细胞分化动物体细胞分化 程度高，恢复其程度高，恢复其 全能性十分困难全能性十分困难 2、原理：原理： 动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性 4、体细胞核移植过程、体细胞核移植过程-示动物克隆示动物克隆-无性繁殖无性繁殖 1.）克隆羊多）克隆羊多 利培育过程：利培育过程： 黑面绵羊去黑面绵羊去 核卵母细胞核卵母细胞 白面绵羊乳白面绵羊乳 腺细胞核腺细胞核 细胞核移植细胞核移植 重组细胞重组细胞 电脉冲刺激电脉冲刺激 早期重组胚胎早期重组胚胎 胚胎移植胚胎移植 另一头绵羊的子宫另一头绵

20、羊的子宫 妊娠、出生妊娠、出生 克隆羊多利克隆羊多利 特别注意：特别注意：克隆动物性状克隆动物性状 与供体动物完全一样吗？与供体动物完全一样吗？ 不可能！不可能！因为：因为： 一、供体动物只提供细胞核，一、供体动物只提供细胞核， 而细胞质中的遗传物质（如而细胞质中的遗传物质（如 线粒体线粒体dna）来自于受体卵）来自于受体卵 母细胞母细胞. 二、生物的性状不仅与遗传二、生物的性状不仅与遗传 物质有关，还受环境的影响。物质有关，还受环境的影响。 供体供体 受体受体 代孕代孕 受体受体 黑面绵羊去黑面绵羊去 核卵母细胞核卵母细胞 白面绵羊乳白面绵羊乳 腺细胞核腺细胞核 a 重组细胞重组细胞 电脉冲

21、刺激电脉冲刺激 早期重组胚胎早期重组胚胎 b 另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫 妊娠、出生妊娠、出生 克隆羊多利克隆羊多利 1、写出、写出ab所代表细胞工程名称：所代表细胞工程名称：a表示：表示： b表示表示: 2、实施细胞工程时，所需、实施细胞工程时，所需 受体细胞大多采用卵母细胞受体细胞大多采用卵母细胞 的原因：的原因： 体积大，易操作。含有促使细胞核体积大，易操作。含有促使细胞核 表达全能性的物质和营养条件。表达全能性的物质和营养条件。 3 3、多利面部毛色是：、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。根据遗传学原理说明判断依据。 4 4、若黑面绵羊的基因型为、若黑面绵羊的基因型为

22、aa,aa,白白 面绵羊的基因型为面绵羊的基因型为aaaa，则克隆羊，则克隆羊 的基因型为的基因型为 核移植核移植 胚胎移植胚胎移植 白色白色 多利全部的核基因都来自白面绵羊多利全部的核基因都来自白面绵羊 aa 取供体细胞取供体细胞 传代培养传代培养1010代代 以内的细胞以内的细胞. . 为什么？为什么？ 用的是去用的是去 核的减数核的减数 第二次分第二次分 裂中期细裂中期细 胞（胞（m中中 期期）为什）为什 么？么？激活方法：激活方法： 激活目的：激活目的： 促融方法：促融方法： 电刺激电刺激 胚胎移植至胚胎移植至 代孕受体内代孕受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩 2.）核移植流程）核移植流程

23、供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛 受体：普通奶牛（卵受体：普通奶牛（卵 母细胞的采集与培养）母细胞的采集与培养） 1.体积大，易体积大，易 操作。操作。2.含有含有 促使细胞核表促使细胞核表 达全能性的物达全能性的物 质和营养条件。质和营养条件。 有人说它三个母有人说它三个母 亲，对吗？亲，对吗？ 核移植流程核移植流程: 1、供体细胞的采集与培养、供体细胞的采集与培养 5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减 数分裂进程。数分裂进程。 6电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重 组胚胎。组胚胎。 4、

24、将供体细胞注入去核卵母细胞、将供体细胞注入去核卵母细胞 3、显微操作去除卵母细胞中的核、显微操作去除卵母细胞中的核 2、受体卵母细胞的采集与体外培养、受体卵母细胞的采集与体外培养 7、胚胎移植入代孕母牛体内、胚胎移植入代孕母牛体内 8、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。、妊娠分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。 4.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景 5.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题 看书看书p49-50p49-50页页 下图所示为用两栖动物卵所做的实验图解，据图回答下图所示为用两栖动物卵所做的实验图解，据图回答 下列问题：下列问题： 蝌蚪肠上皮细胞

25、核中含有青蛙发育所需的蝌蚪肠上皮细胞核中含有青蛙发育所需的_， 重新组合的细胞相当于蛙的重新组合的细胞相当于蛙的_ 细胞，经过细胞，经过 _ _ 和和_形成组织和器官。形成组织和器官。 全部基因全部基因 受精卵受精卵 细胞分裂细胞分裂 细胞分化细胞分化 本实验结果说明本实验结果说明_具有全能性，具有全能性， 图中图中a a过程采用的技术手段称做过程采用的技术手段称做_。 动物体细胞核动物体细胞核 核移植技术核移植技术 1 1、定义：、定义：指用自然或人工方指用自然或人工方 法使两个或多个不同的细胞法使两个或多个不同的细胞 融合成一个细胞的过程。融合成一个细胞的过程。 一、动物细胞融合一、动物细

26、胞融合 细胞杂交：细胞杂交：不同基因型的细不同基因型的细 胞之间的融合就是胞之间的融合就是细胞杂交细胞杂交。 杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具融合后形成的具 有原来有原来两个或多个细胞遗传两个或多个细胞遗传 信息信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细成为杂交细 胞胞。 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动 两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用 动物动物 细胞细胞 融合融合 2、诱导融合的因素诱导融合的因素 生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒诱导融诱导融 合合.(.(利用灭活仙台病毒是动物细利用灭活仙台病毒是动物细 胞融合所特有的。胞融合所特有的。 这是由于病毒这是由于

27、病毒 的磷脂外衣与动物细胞的膜十分的磷脂外衣与动物细胞的膜十分 相似的缘故。病毒外壳上的某些相似的缘故。病毒外壳上的某些 糖蛋白可能还有促进细胞融合的糖蛋白可能还有促进细胞融合的 功能。功能。) ) 化学法：化学法：聚乙二醇聚乙二醇pegpeg诱导融诱导融 合合. . 物理法：物理法：电激电激融合融合 病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面 细胞膜连接细胞膜连接 细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通 细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞 3 3、动物细胞融合技术的应用、动物细胞融合技术的应用 细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使 远缘杂交成

28、为可能。远缘杂交成为可能。 利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。 人们获得抗体的传统方法是人们获得抗体的传统方法是? ? 将抗原注入动物体将抗原注入动物体, ,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体 这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么? ? 效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可效率低，产量

29、有限，纯度低，动物抗体注入人体可 能产生严重的过敏反应。能产生严重的过敏反应。 运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？ 能否用单个能否用单个b b淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来 产生单一类型的抗体呢？产生单一类型的抗体呢？ b b淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。 二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 思思 考考 抗体的传统生产方法抗体的传统生产方法 从从 血血 清清 中中 分分 离离 抗抗 体体 该法制备抗体的特点：该法制备抗体的特点： 产量低、

30、纯度低，且抗产量低、纯度低，且抗 体的特异性差、灵敏度低。体的特异性差、灵敏度低。 多多 种种 效效 应应 b 细细 胞胞 动动 物物 体体 内内 多多 种种 抗抗 体体 抗抗 原原 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的b b淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖能和具有无限增殖能 力的力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交 瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一 的特异性抗体。这种的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原单

31、一类型的只针对某一特定抗原 决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 米尔斯坦米尔斯坦( (阿根廷阿根廷) )和科勒和科勒( (德国德国) )因此在因此在19841984年获诺年获诺 贝尔奖。贝尔奖。 提取提取 用特定的用特定的选选 择性培养基择性培养基 单抗单抗 的制的制 备过备过 程要程要 点：点： 注射抗原注射抗原 b b淋巴细胞淋巴细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 融合融合 多种杂多种杂 交细胞交细胞 选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1 专一抗专一抗 体检测体检测 克隆化克隆化 单克隆单克隆 抗体抗体 有限稀释法培养有限稀释法培养 筛选筛选2 2 1.注射抗

32、原的目的注射抗原的目的 是什么？是什么？ 注射抗原注射抗原 b b淋巴细胞淋巴细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 融合融合 多种杂多种杂 交细胞交细胞 选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1 专一抗专一抗 体检测体检测 克隆化克隆化 单克隆单克隆 抗体抗体 有限稀释法培养有限稀释法培养 筛选筛选2 2 2.诱导细胞融合的诱导细胞融合的 手段有哪些？手段有哪些？ 注射抗原注射抗原 b b淋巴细胞淋巴细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 融合融合 多种杂多种杂 交细胞交细胞 选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1 专一抗专一抗 体检测体检测 克隆化克隆化 单克隆单克隆 抗体抗体 有限稀释法培养有限稀释法培养 筛

33、选筛选2 2 3.若细胞两两融合后，若细胞两两融合后， 有几种融合情况？有几种融合情况？ 注射抗原注射抗原 b b淋巴细胞淋巴细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 融合融合 多种杂多种杂 交细胞交细胞 选择性培养基选择性培养基 筛选筛选1 1 专一抗专一抗 体检测体检测 克隆化克隆化 单克隆单克隆 抗体抗体 有限稀释法培养有限稀释法培养 筛选筛选2 2 4.第一次筛选出的杂交瘤第一次筛选出的杂交瘤 细胞为何需进行克隆化培细胞为何需进行克隆化培 养和专一抗体检测？养和专一抗体检测？ 5.5.实际操作中如何经过两次筛选获得能产生特异实际操作中如何经过两次筛选获得能产生特异 性抗体的杂交瘤细胞？性抗体的杂交瘤

34、细胞？ 有限稀释法有限稀释法 稀释多次稀释多次 稀释稀释 将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法 有：酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。有：酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。 1.动物特异性免疫动物特异性免疫 2.分离分离b淋巴细胞（淋巴细胞（b）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（g）。注意）。注意b淋巴细淋巴细 胞是一个系列。（胞是一个系列。（b1,b2,b3,-bn） 3.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:（bb;bg;gg） 4.第一次筛选：在第一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细

35、胞 （只有（只有bg杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但bg杂交瘤细胞也是一个系列：杂交瘤细胞也是一个系列： 如如b1g,b2g-bng。而。而bb,gg在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。） 5.第二次筛选：在第二次筛选：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列每孔每孔 只放一个杂交瘤细胞。只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进每个杂交瘤细胞，并进 行行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交的孔内即是所需要的杂交 瘤细胞。瘤细胞。 6.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体

36、外培养体外培养或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔 内增殖内增殖。提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。 4 4）、如何进行第）、如何进行第2 2次筛选？次筛选？ 培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。 第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2 2次筛选得次筛选得 到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。 问题强化：问题强化： 1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？ 免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理 2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与b b细胞融合？细胞融合？ 这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质， 不仅具有不仅具有b b细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的 本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体 1、作为诊断试剂作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、在临床生化诊断、病理组织定位、 体内肿瘤的定位等体内肿瘤的定位等, ,与常