开题报告初稿VIP

1、多种特异性结核抗原联合应用检测血清中结核抗体的探索一、 立论依据(一) 结核病是临床上常见而较难早期确诊的疾病， 血清学诊断可成为结核病的快速辅助诊断手段，但由于特异性欠强，敏感性低，尚需进一步研究。结核病血清学方法主要是检测血清和组织液中的特异性抗结核抗体。结核抗原的选择至关重要。目前常用的抗原性物质有3 种: (1) 结核菌蛋白; (2) 结核菌胞壁脂多糖;(3) 结核菌体。由于结核抗原多而复杂，结核病患者的抗体谱呈现出多样性。Lyashchenko等用10种重组结核分枝杆菌蛋白抗原检测结核病患者血清中的特异性抗体，结果显示近90%的结核病患者血清中至少存在一种抗结核抗体，抗体在体内表达的

2、数量、种类及水平可以随患者的免疫背景、疾病的不同阶段以及结核杆菌菌株的不同而不同。结核病患者的抗体反应是针对多种结核抗原的，任何一种抗原都无法检测结核病患者血清中所有的抗结核抗体，因此联合多种抗原进行检测，在保证特异性的基础上有助于提高诊断的敏感性。目前血清学研究的主要方向是筛选多个纯化的特异性抗原组成联合抗原，以便增加血清学诊断的敏感性。近年来我国应用基因工程技术克隆、表达MT 基因,简便地获得了大量MT 单一的蛋白抗原( 如CFP10、ESAT6、MPT63、MPT64、Ag85A、Ag85B、KatG、16 000、38 000、65 000 等蛋白) 为我国应用特异性结核抗原检测血清中

3、结核抗体提供了可能。(二) 常见抗原： 脂阿拉伯甘露聚糖抗原(LAM)。LAM是结核菌细胞壁上的主要脂多糖成分，它在生长中的结核菌表而能大量表达。LAM核心骨架为甘露聚糖，侧链为甘露糖、阿拉伯糖单位，分r以磷脂酞肌醇C MIP)的形式锚在胞质膜上，LAM抗原表位存在于阿拉伯甘露聚糖单位上。小同种间、株间LAM存在差异，主要体现在其非还原端阿拉伯糖单位。构成形式即花色上。目前研究表明LAM至少有两种存在形式:来源于HRa的ara LAM和来源于HRv的man LAM。抗LAM抗体大多结合在araLAM非还原端阿拉伯糖单位抗原表位上，而具有毒性的manLAM可能在疾病的致病过程中起着更为重要的作用

4、。Park等sa对细菌学确诊的27例结核性脑膜炎患者发现，23例(85.2070)结核患者脑脊液中LAM-IgG为阳性，而无菌性脑膜炎及其它神经系统疾病组78例患者中仅3例阳性，特异性达95.9070。因此认为检测脑脊液中特异性LAM抗体对结核性脑膜炎诊断有价值。Park等)sa)对细菌学确诊的27例结核性脑膜炎患者发现，23例(85.2070)结核患者脑脊液中LAM-IgG为阳性，而无菌性脑膜炎及其它神经系统疾病组78例患者中仅3例阳性，特异性达95.9070。因此认为检测脑脊液中特异性LAM抗体对结核性脑膜炎诊断有价值。 A60抗原是一种能被分解成单一成分的脂一多糖一蛋白集合物，是旧结素和

5、PPD的主要组成成分。作为一种强有力的免疫原，能激发特异的免疫应答及迟发型超敏反应. 在印度，Gupta等以A60作为抗原检测4_52例结核及161例对照儿童血清中特异性IgM和IgA抗体，敏感性为75.5070，特异性为9207030。对于337例结核和131例对照成人，IgG和IgA的敏感性达91.6070，而特异性保持在90.007030CHiang32等用A60,38KDa,KP90作抗原分别检测活动性结核病人血清中相应的抗体，结果显示A60作为血清学抗原比38KDa,KP90更有效。Anuradha等33检测了神经系统结核患者和其他肺外结核患者脑脊液和血清中的抗A60抗体，诊断结核病

6、的准确率为75%。因此，对于肺外结核病，A60抗原同样具有诊断价值。 14KDa蛋白是a一品状小分r热休克蛋白家族的成员。该蛋白携带有结核杆菌特异性的B细胞表位，用单克隆抗体检测发现其至少存在四种小同的抗原决定簇，能诱导特异的体液免疫应答。7ackett26和Bothamely2等研究发现:原发型结核病患者以及与痰涂片阳性的结核病患者密切接触者的血清中，抗14KDa抗体滴度升高，提示14KDa蛋白在感染初期就具有明显的免疫原性。 CFP 10(Culture filtrate protein 10)与ESAT-6同属于一个家族，是山结核杆菌基因组RD 1区相同的操纵r编码的低分r量蛋白t2 n

7、，只存在于结核分枝杆菌群及其它几种致病性分枝杆菌中，是T细胞的靶抗原，能诱导皮肤迟发型超敏反应步刺激外周血单核细胞产生特异性IFN- 。单独用CFP 10作为抗原检测结核病患者血清中特异性抗体，敏感性低。当与38KDa蛋白联合应用时，CFP 10能检测出对38KDa抗原缺乏反应的结核病患者血清特异性抗体，在保持高特异性的基础上，可以弥补38KDa对涂片阴性结核病患者检测敏感性的小足。 ESAT-6 (6KDa Early Secretory Antigenic Target)是从结核分枝杆菌短期培养滤液中纯化分离出的一种低分r量分泌性蛋白，在结核杆菌感染早期阶段就可被机体识别，具有较强的细胞免

8、疫活性i 。通过对小同分枝杆菌的短期培养滤液进行分析，发现ESAT-6仅在结核分枝杆菌群(包括人型分枝杆菌，牛型分枝杆菌和非洲分枝杆菌)及其它几种致病性分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、Szulgai分枝杆菌、海水分枝杆菌中表达，BCG及其它分枝杆菌小表达ESAT-6，因此，可以将ESAT-6作为致病性结核分枝杆菌感染的特异性诊断试剂。有资料显示对ESAT-6发生体液免疫应答者，70%以上发生的是高水平的抗体反应，但是由于人的T胞对ESAT-6的识别受MHC即HLA的限制，因此，小同结核病流行地区的人对ESAT-6的反应性是小相同的。 Ag8_5复合体是一组具有较强细胞免疫和体液免疫活性的分枝杆菌分

9、泌性蛋白i2最早在结核分枝杆菌和BCG的培养滤液中发现，后来发现Ag8_5可在所有分枝杆菌菌种中引起广泛交叉反应3，说明分枝杆菌各菌株均可分泌。活动性肺结核病患者血清中Ag8_5水平比其它疾病患者和健康对照者高_50 1 _50信，因此可以通过检测血液中的Ag8_5，对活动性结核病加以诊断Ag8_5复合体至少包括Ag8_5A, Ag8_5B和Ag8_5C三种蛋白。Ag8_5B分r量为30KDa，是结核分枝杆菌的主要分泌蛋白，约占分泌蛋白总量的2207030070 0在对结核病的诊断上，Ag8_5B较Ag8_5A和Ag8_5C更有价值由于Ag8_5B蛋白广泛存在于各种分枝杆菌中，而小同的分枝杆菌

10、间存在抗原决定簇的差异，因此可能会影响检测的特异性。 38KDa蛋白(AgS, Pst-1, Pab) 1986年，Young DS等首次以单克隆抗体为基础亲和层析纯化了38KDa蛋白。1989年，Anderson AB6等以PBR322为载体，在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达了该蛋白。38KDa蛋白是一种与磷酸盐转运有关的脂蛋白，含有特异的B淋巴细胞和T淋巴细胞抗原决定簇，对小鼠、豚鼠和人类B细胞具有免疫优势，能诱导早期反应。Haslov等7比较了_5种结核杆菌抗原，发现38KDa蛋白的免疫学活性最强，是结核杆菌的主要免疫原。缺乏抗38KDa抗体的血清很难与结核杆菌其它抗原发生反应。38KD

11、a抗原对痰涂片阳性结核病的诊断具有较高的敏感性，但对痰涂片阴性结核病的诊断敏感性低。Wilkinson等9以重组38KDa蛋白为抗原检测225例结核病患者、34例健康者、24例其他疾病患者血清中特异性抗体，敏感性为63.1 070，特异性为94.9070 0其中，涂(+)培(+)患者敏感性为78.4070，明显高丁涂O)培C)患者敏感性37.7070, 76%涂C)培(+)患者血清中含有抗38KDa抗体何秀云等po以重组38KDa蛋白和PPD为抗原检测BCG接种阳转健康者，38KDa检测的特异性明显高于PPD，从某种意义上可以说，38KDa抗原能将结核病患者与BCG接种阳转者区别开来，这可能与

12、BCG虽然具有编码38KDa蛋白的基因，但其蛋白的合成与表达受到抑制有关。 (三) 结核病血清学影响血清学诊断敏感性和特异性的因素很多，除所有抗原的特异性和纯化程度、机体的细胞和体液免疫状态外，采用的检测方法也是一个重要影响因素。目前用于血清血诊断的方法主要有：酶联免疫吸附试验、斑点免疫金渗虑法以及免疫印记法。主要参考文献1 吴雪琼。我国结核病实验室诊断研究的主要进展。中华结核和呼吸杂志，2003， 26：478.2 丽蓉，综述，罗永艾，等。结核病血清学诊断的新进展，中华结核和呼吸杂志，25：269。3 王民。应重视结核病的实验诊断，中华检验医学杂志，2005，28：770。4 中华结核和呼吸

13、杂志编辑委员会。抗结核抗原的IGG抗体测定(ELISA法)在肺结核诊断的应用。中华结核和呼吸杂志。1988 11: 2225 全国结核病流行病学抽样调杳技术指导组，全国结核病流行病学抽样调杳办公室.2000年全国结核病流行病抽样调杳报告.中国防瘩杂志，2002,24(2): 65二、研究目标研究多种特异性结核抗原联合应用对结核血清学诊断的价值，从中找到最经济，灵敏度，特异度都较高的结核抗原组合。三、研究内容通过ELISA法用各种结核抗原联合诊断血清结核抗体。七种抗原用正交分析方法分析其合理组合。四、拟解决的关键问题 抗原种类数量较多，组合的方法也较多，会带来较大的工作量和资金消耗。同时，抗原的取得和血清的来源也是较大的问题。五、研究方法、技术路线、试验方法 采用高纯度结核分支杆菌纯蛋白衍生物作抗原,应用ELISA 检测血清抗结核抗体,测定试剂盒可由生物公司提供,按试剂盒说明书操作,在终止反应后,用酶标仪、波长490nm 测定