分子生物学 第6章 真核生物的转录

1、Molecular Biology Course 第六章第六章 真核生物基因的转录真核生物基因的转录 教学要求教学要求 u理解真核生物基因转录的特点理解真核生物基因转录的特点 u掌握聚合酶掌握聚合酶I、聚合酶、聚合酶和酶和酶III作用基因作用基因 转录的起始转录的起始 u了解真核生物基因转录所参与的转录因了解真核生物基因转录所参与的转录因 子子 第第1节节 三种三种RNA聚合的特性和功能聚合的特性和功能 第第2节节 聚合酶聚合酶I基因：核糖体重复基因：核糖体重复 第第3节节 RNA聚合酶聚合酶III基因：基因：5s 和和tRNA转录转录 第第4节节 RNA聚合酶聚合酶II基因：启动子和增强子基

2、因：启动子和增强子 主要内容主要内容 第第5节节 通用转录因子与通用转录因子与RNA聚合酶聚合酶II的起始的起始 第第1节节 三种三种RNA聚合的特性和功能聚合的特性和功能 一、真核生物一、真核生物RNA聚合酶聚合酶 二、真核生物二、真核生物RNA聚合酶的活性聚合酶的活性 TypeLocation 位置位置 Transcription product 转录产物转录产物 a-amanitin 对-鹅膏蕈碱 的敏感性 RNA Pol INucleoli 核仁核仁 Most rRNAsInsensitive 不敏感不敏感 RNA Pol IINucleo- plasm 核质核质 hnRNA , sn

3、RNAVery sensitive 非常敏感非常敏感 RNA Pol IIINucleo- plasm 核质核质 tRNAs, 5S rRNA, snRNA and other small RNAs Moderately sensitive 中度敏感中度敏感 一、真核生物一、真核生物RNA聚合酶聚合酶 mRNA rRNA tRNA snRNA scRNA 7S RNA micro RNA There Are Many Functional Classes of RNA Molecular BiologyMolecular Biology 500-700kDa, 12+ subunits, 含有

4、两个大的亚含有两个大的亚 基基 最大亚基与大肠杆菌最大亚基与大肠杆菌RNA聚合酶的聚合酶的 亚基相似，亚基相似， 另外一个与另外一个与亚基相似。亚基相似。 根据其结构与功能，可分为核心亚基、共同亚根据其结构与功能，可分为核心亚基、共同亚 基、非必需亚基基、非必需亚基 RNA polymerase 亚基亚基 Molecular BiologyMolecular Biology l CTD中的中的 Ser和和 Thr可被高度磷酸化可被高度磷酸化 磷酸化的磷酸化的 RNApol 被称为被称为A 非磷酸化的 非磷酸化的 RNApol 称为称为B l CTD参与转录参与转录 B A 使使 RNApol易

5、于离开启动子进入延伸过程易于离开启动子进入延伸过程 （10倍）倍） Similar Structures of Bacterial (left) and Eukaryotic (right) RNA Polymerases Molecular BiologyMolecular Biology 二、真核生物二、真核生物RNA聚合酶的活性聚合酶的活性 Section M Transcription in Eukaryotes 转录机制与大肠杆菌转录机制与大肠杆菌RNA聚合酶相似聚合酶相似 (How?) 需要辅助因子才能结合到需要辅助因子才能结合到DNA上上 Like bacterial RNA p

6、olymerases, each of the eukaryotic enzymes catalyzes transcription in a 5 to 3 direction and synthesizes RNA complementary to the antisense template strand. The reaction requires the precursor nuckeotides ATP，GTP， CTP and UTP and does not requires a primer for transcription initiation. The purified

7、eukaryotic RNA polymerases, unlike the purified bacterial enzymes, require the presence of additional initiation proteins before they are able to bind to promoters and initiate transcription. Eukaryotic RNA polymerase activities Molecular BiologyMolecular Biology 第第2节节 RNA聚合酶聚合酶I基因：核糖体重复基因：核糖体重复 一、一

8、、rRNA 基因的结构基因的结构 二、二、RNA聚合酶聚合酶I启动子和结合因子启动子和结合因子 三、三、 其他其他rRNA基因基因 一、一、rRNA 基因的结构基因的结构 1. 核糖体 RNA 基因基因 一个拷贝的一个拷贝的18S，5.8S和和28SrRNA基因组成一基因组成一 个的转录单元个的转录单元 前前RNA转录单元在基因组中成簇排列，中间被转录单元在基因组中成簇排列，中间被 非转录的间隔序列分开。非转录的间隔序列分开。 A single transcription unit Tandem array 一、一、rRNA 基因的结构基因的结构 2. 核仁的作用核仁的作用 rRNA基因簇排列

9、成环一起组成核仁，即核基因簇排列成环一起组成核仁，即核 仁组织区域。仁组织区域。 前前rRNA转录物与转录物与rRNA基因一起包装成电镜基因一起包装成电镜 下可见的下可见的“圣诞树结构圣诞树结构” rRNA的生产和修饰区域。的生产和修饰区域。 Christmas Tree Structures 二、二、RNA聚合酶聚合酶I启动子和结合因子启动子和结合因子 1. RNA Pol I promoters 启动子启动子 即即型启动子，由型启动子，由2部分保守序列组成：部分保守序列组成： u 核心启动子（核心启动子（core promoter）或核心元件）或核心元件 （core element），位于

10、），位于-45到到+20，负责转录的，负责转录的 起始。起始。 u 上游控制元件（上游控制元件（upstream control element , UCE），从），从-180延伸到延伸到-107，可增加核心元件，可增加核心元件 的转录起始的效率。的转录起始的效率。 Core element -45 +20-100 UCE UCE: Upstream control element RNA Pol I promoters in human cells 二、二、RNA聚合酶聚合酶I启动子和结合因子启动子和结合因子 2. Upstream binding factor (UBF) 上游结上游结 合

11、因子合因子 u能结合到能结合到UCE以及核心元件上游的不同位点，使两个以及核心元件上游的不同位点，使两个 位点之间的位点之间的DNA环化。环化。 uessential for high level of transcription 二、二、RNA聚合酶聚合酶I启动子和结合因子启动子和结合因子 3. 核心结合因子核心结合因子 Selectivity factor 1 (SL1) 选择因子选择因子1 u 含有含有4个亚基个亚基 TBP(TATA-binding protein):. 一个通用转录因子，一个通用转录因子， 使使RNA聚合酶结合到起始位点起始转录所必需的。聚合酶结合到起始位点起始转录所

12、必需的。 TAF1s: RNA Pol I转录特有的转录特有的TBP-相关因子相关因子 3. Selectivity factor 1 (SL1) 选择因子选择因子1 u功能功能 结合并稳定结合并稳定UBF-DNA复合物复合物 能与核心元件游离的下游部分相互作用能与核心元件游离的下游部分相互作用 使使RNA Pol I结合并起始转录。结合并起始转录。 二、二、RNA聚合酶聚合酶I启动子和结合因子启动子和结合因子 UBF：A specific DNA-binding protein,called upstream binding factor, binds to the UCE SL1: An

13、additional factor called selectivity factor 1, is essential for RNA Pol transcription. SL1 binds to and stabilizes the UBF-DNA complex and interacts with free downstream part of the core element. TBP：One of the subunits of SL1, called TATA-binding protein, is required for initiation by all three euk

14、aryotic RNA polymerases. TAFI s（TBP-associated factors）：as the other subunits of SL1 and required for RNA polytranscription called TAF s。 Upstream binding factor Schematic model for rRNA transcription initiation Molecular BiologyMolecular Biology The initiation complex UBF UBF RNA Pol I TBP TAFIs TA

15、FIs TAFIs RNA聚合酶聚合酶I的转录起始复合物装配的转录起始复合物装配 两个两个UBF分别特异性地结合到上游控制元件分别特异性地结合到上游控制元件 (UCE）和核心启动子上，通过）和核心启动子上，通过UBF蛋白质的蛋白质的 相互作用，使相互作用，使UCE与核心启动子之间的与核心启动子之间的DNA形形 成环状结构成环状结构 SL-1结合到结合到UBF-DNA复合物上复合物上 RNA聚合酶聚合酶I就结合到核心启动子上，形成开就结合到核心启动子上，形成开 放性起始复合物放性起始复合物。 三、三、 其他其他rRNA基因基因 在简单的真核生物中在简单的真核生物中, rRNA 基因基因 只有一个

16、控制元只有一个控制元 件，位于转录起始位点上游的件，位于转录起始位点上游的12-72 bp处。处。 Simple initiation: TIF (homolog of SL-1) binds to the promoter RNA Pol I bind TIF remains bound and the RNA Pol I is released for elongation. 第第3节节 RNA聚合酶聚合酶III基因：基因：5s 和和tRNA转录转录 一、一、 RNA polymerase III 二、二、 tRNA genes 三、三、 5S rRNA genes 一、一、 RNA po

17、lymerase III 至少含有至少含有16个亚基个亚基 位于核质位于核质 合成前体合成前体5S rRNA、tRNA和其他小分子核及和其他小分子核及 胞质胞质RNAs 一、一、 RNA polymerase III RNA polymerase III 启动子启动子 分为二类，每种识别方式不同分为二类，每种识别方式不同 内部启动子：由起始位点下游的两个序列组成，内部启动子：由起始位点下游的两个序列组成， A框和框和B框框(C框框) 上游启动子：上游启动子： 由起始位点上游的序列组成由起始位点上游的序列组成(DSE, PSE, TATA).。 转录控制区位于转录起始点的转录单位内转录控制区位于

18、转录起始点的转录单位内 二、二、 tRNA genes 1. transcription control regions 转录调控区域转录调控区域 位于转录单元内的转录起始位点之后位于转录单元内的转录起始位点之后 含量有两个高度保守的调控序列：含量有两个高度保守的调控序列： A box and B box A box: 5-TGGCNNAGTGG B box: 5-GGTTCGANNCC 编码编码tRNA分子中的分子中的D-环和环和T -环环 二、二、 tRNA genes 2. 两个复杂的两个复杂的DNA-结合因子结合因子 TFC：能与能与A框和框和B框结合，是定位框结合，是定位TFB的包的

19、包 装因子装因子 TFB:能结合能结合A框框50bp的上游序列；由的上游序列；由TBP、BRF 和和B 三个亚基组成。可使三个亚基组成。可使RNA聚合酶聚合酶III结合进来并结合进来并 起始转录。起始转录。 3. tRNA基因转录起始复合物的装配基因转录起始复合物的装配 TFIIIC结合到结合到A框和框和B框上框上 TFIIIB结合于结合于A框上游约框上游约50bp的位置，并只与的位置，并只与 TFIIIC相互作用，而与相互作用，而与DNA序列无关序列无关 RNA聚合酶结合于聚合酶结合于TFIIIB-TFIIIC-DNA复合物，复合物， 随后，随后，TFIIIC从该复合物释放出来。从该复合物释

20、放出来。 三、三、 5S rRNA genes 1. 唯一单独被转录的唯一单独被转录的rRNA亚基，并也是亚基，并也是 串联排列在基因簇中。串联排列在基因簇中。 2.Transcription control regions (promoter) A box:+50 to +65 C box: +81 to +99 三、三、 5S rRNA genes 3. 转录因子转录因子 TFIIIA:C框的特异性DNA结合蛋白，作为装配因 子使TFIIIC与与5S rRNA 启动子结合启动子结合 TFIIIC: 能与能与C框、框、A框及起始位点附近的框及起始位点附近的DNA结结 合合 TFIIIB：能与

21、以上结合的复合物相互作用，并促能与以上结合的复合物相互作用，并促 使使Pol III结合而起始转录。结合而起始转录。 5SrRNA基因转录起始复合物的装配基因转录起始复合物的装配 TFIIIA结合于结合于C框框 TFIIIC结合到结合到TFIIIA上上 TFIIIB与与TFIIIC接触，并结合到上游接触，并结合到上游DNA序序 列上列上 RNA聚合酶聚合酶III依赖依赖TFIIIB，结合到，结合到5SrRNA基基 因的转录起始位点，形成转录起始复合物。因的转录起始位点，形成转录起始复合物。 1 型内部启动子型内部启动子 2 型内部启动子型内部启动子 转录起始点转录起始点 转录起始点转录起始点

22、boxA boxC boxA boxB TFIIIA TFIII B TFIII C TFIII B Plo III Pol III TFIII C TFIII C 第第4节节 RNA聚合酶聚合酶II基因：启动子和增强子基因：启动子和增强子 一、一、RNA polymerase II 二、二、Promoters 一、一、RNA polymerase II 位于核质中位于核质中 用于所有蛋白质编码基因用于所有蛋白质编码基因mRNA前体的合成前体的合成 前体前体mRNA需经过加冒、加尾及剪接等加工需经过加冒、加尾及剪接等加工 过程。过程。 二、二、 Promoters TATATATA框框 核心元

23、件核心元件 起始子（起始子（initiatorinitiator，InrInr） TFIIBTFIIB识别元件识别元件 下游启动子元件下游启动子元件 CAAT boxCAAT box、 类启动子类启动子 上游元件组成上游元件组成 GC boxGC box Oct Oct 增强子（增强子（enhomcerenhomcer） 远端调控区远端调控区 减弱子（减弱子（dehancerdehancer） 静息子（静息子（sisencersisencer） 上游激活序列（上游激活序列（upstream activatingupstream activating seguences UASs seguenc

24、es UASs） 1. 起始子起始子 起始点一般没有同源序列 mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py组成称为起始 子（initiator)。（在原核CAT起始序列也有这种情 况）。 一般由P PY2 Y2AN(T/A)P AN(T/A)PY5 Y5构成 位于-3+5 提供RNA pol 识别。 无论TATA是否存在，Inr对启动子的强度和起始位点的 选择都是重要的 。 现已纯化了Inr 结合蛋白。 2. TATA box uTATA box TATA框框 位于起始位点上游的位于起始位点上游的25-35bp处处 a 7 bp consensus sequence 一个一个7bp的保守序的保守

25、序 列列 5-TATA(A/T)A(A/T)-3. uTATA box TATA框框 选择正确的转录起始位点，保证精确起始，选择正确的转录起始位点，保证精确起始， 故也称为选择子故也称为选择子 影响转录的速率。影响转录的速率。 The spacing between the box and start site is important TATA box Transcription Transcriptional start site DNA Coding-strand sequences: TATAAAA GC + CAAT boxes 100 5025 +1 Py2CAPy5 Promot

26、ers TATA box: Many eukaryotic promoters contain a sequence called the TATA box around 25-35 bp upstream from the start site of transcription. It has the 7 bp consensus sequence 5-TATA（A/T）A（A/T）-3 although it is now known that the protein which binds to the TATA box, TBP, binds to an 8 bp sequence t

27、hat includes an additional downstream base pair, whose identity is not important. Initiator element: The initiator element is located around the transcription strt site. Many initiator elements have a C at -1 and A at +1. Molecular BiologyMolecular Biology 3. TFIIB识别元件识别元件 保守序列：保守序列：(G/C) (G/C) (G/A

28、) CGCC 能促进能促进TFIIB与与DNA结合的元件结合的元件 4. 下游启动子元件下游启动子元件(DPE) 位于起点下游约位于起点下游约30bp处处 保守序列：保守序列：G(A/T)CG 能与通用转录因子能与通用转录因子TFIID结合结合 补偿因补偿因TATA框缺失造成的转录抑制。框缺失造成的转录抑制。 6. 上游调控元件上游调控元件 CAAT box (CCAAT) SP1 box GCbox (GGGCGG) ) uFunction： 控制转录效率控制转录效率 .上游启动子元件（上游启动子元件（UPEUPE） 表表12-4 12-4 哺乳动物哺乳动物RNA Pol RNA Pol 上

29、游转录因子结合的元上游转录因子结合的元 元件元件 保守序列保守序列结合结合DNADNA的长度的长度 蛋白质因子蛋白质因子 TATAboxTATAAAA 10bp TBP CAAT boxGGCCAATCT 22bp CTF/NF1 GC boxGGGCGG 20bp SP1 OctamerATTTGCAT 20bp Oct-1 OctamerATTTGCAT 23bp Oct-2 KB GGGACTTTCC 10bp NFKB ATF GTGACGT 20bp ATF B. Lewin:B. Lewin:GENESGENES.1997,Table 28.2.1997,Table 28.2 真核

30、启动子含有不同的组件真核启动子含有不同的组件 SV40 SV40 早期启动子早期启动子 胸苷激酶胸苷激酶 组蛋白组蛋白H2B -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 +1 Oct CAAT GC TATA 7. Enhancers 增强子增强子 u能从启动子的上游或下游数千个碱基处激活转录的序列能从启动子的上游或下游数千个碱基处激活转录的序列 元件元件 uGeneral characteristics of Enhancers 增强子的基本特性增强子的基本特性 赋予其相连基因从正确的起始位点的强转录活性赋予其相连基因从正确的起始位点的强转录活性 不管位于其连接的基因的上游

31、或下游均可激活转录不管位于其连接的基因的上游或下游均可激活转录 可在远离起始位点处发挥作用可在远离起始位点处发挥作用 优先激活两个串联的启动子中距离最近的一个。优先激活两个串联的启动子中距离最近的一个。 晚期区 SV40 无 核小体区 早期区 T3 T2 T1 72bp 72bp 21 21 22 Ori 250 107 103 47 TAT A 0/5245 GGTGTGGAAAG CCGCCC 图 图12- SV40复制起始中的增强子复制起始中的增强子 增强子作用机理： 结构基因 GCGCCAATTATA 内含子外显子外显子 转录起始 CAAT盒 GC盒 增强子 顺式作用元件 TATA盒

32、(Hogness box) 第第5节节 通用转录因子与通用转录因子与RNA聚合酶聚合酶II的起的起 始始 一、一、RNA聚合酶聚合酶II基本转录因子基本转录因子 二、二、 TFIID (TBP) 三、三、 TFIIA 四、四、 TFIIB 和和 RNA Pol 的结合的结合 五、五、 RNA聚合酶结合后的其他转录因子聚合酶结合后的其他转录因子 六、六、 由由TFIIH介导的介导的CTD 磷酸化磷酸化 一、一、RNA聚合酶聚合酶II基本转录因子基本转录因子 广泛存在于各类细胞中广泛存在于各类细胞中DNA结合蛋白，结合蛋白，RNA 聚合酶聚合酶II催化基因转录所必需的蛋白质因子。催化基因转录所必需

33、的蛋白质因子。 需要多种需要多种TF参与：参与：TFA-J 二、二、 TFIID: 多蛋白复合体，由多蛋白复合体，由TBP 和和TAFIIs组成组成 TBP是唯一一种能与是唯一一种能与 TATA box相结合的蛋相结合的蛋 白质。白质。 TBPTATA box-binding protein, TATA框结合蛋 白，高度保守，分子量38kD。 所有 RNApol的转录起始都需要TBP： 在 RNApol的转录起始过程中,TBP是选择 因子SL1的组分，起定位RNApol的作用 RNApol的转录起始由TBP识别TATA框 在 RNApol 的转录起始过程中,TBP起定位 RNApol 的作用

34、T B P 起 定 位 作 用起 定 位 作 用 , 所 以 又 称 定 位 因 子所 以 又 称 定 位 因 子 （positioning factor） Pol III 启启 动动 子子 Pol I 启启 动动 子子 Pol II 启启 动动 子子 TBP TF III B TF III C RNA Pol III TBP RNA Pol II TF II D 转录起始点转录起始点 TATA TBP SL1 RNA Pol I UBF1 TBP DNA TBP: Has a saddle structure(鞍马形结构鞍马形结构) with an overall dyad symmetry

35、(完全二元对称的结构完全二元对称的结构). Outer surface (with ?) Inner surface (with ?) TBP causes DNA bending TBP 45o Kink (纽结纽结) TBP-DNA复合物空间构象变化的意义：复合物空间构象变化的意义： 使转录因子与使转录因子与RNA聚合酶聚合酶II更紧密地与更紧密地与DNA 位点结合位点结合 由于由于TATA框序列的变形弯曲，相当于双螺框序列的变形弯曲，相当于双螺 旋的局部解链，有助于旋的局部解链，有助于DNA形成开放型起形成开放型起 始复合物。始复合物。 三、三、 TFIIA 与与 TFIID结结 合合

36、稳定稳定 TFIID- DNA复合物复合物 去除阻遏蛋白去除阻遏蛋白 的作用的作用 至少有至少有3个亚个亚 基基 四、四、 TFIIB & RNA Pol binding binds to TFIID Binds to RNA Pol with TFIIF TFIIB起到桥梁起到桥梁 的作用。的作用。 决定转录起始位决定转录起始位 置置 TFIIF：RNA聚合酶聚合酶II结合蛋白，作用类结合蛋白，作用类 似于似于亚基，具有解旋酶的活性亚基，具有解旋酶的活性 TFIIE binding Necessary for transcription 与与RNA聚合酶作聚合酶作 用促进转录用促进转录 五、

37、五、 Factors binding after RNA Pol. TFIIE TFIIJ, TFIIH binding Necessary for transcription 5. Factors binding after RNA Pol. TFIIJ、TFIIH 6. phosphorylation of the polymerase CTD by TFIIH Formation of a processive RNA polymerase complex and allows the RNA Pol to leave the promoter region. RNA聚合酶复合体的形成聚

38、合酶复合体的形成 TFIIH 在转录延伸的调控上具有非常重要的作在转录延伸的调控上具有非常重要的作 用。用。 参与了细胞周期的参与了细胞周期的RNA聚合酶转录和聚合酶转录和DNA 修复的调控作用过程。修复的调控作用过程。 CTD phosphorylation by TFIIH TFIIH是大分子多亚基复合蛋白，具有激酶和解旋酶活是大分子多亚基复合蛋白，具有激酶和解旋酶活 性，能使性，能使RNA聚合酶的聚合酶的CTD磷酸化。磷酸化。 这种磷酸化能使这种磷酸化能使 RNA聚合酶离开启动子，进入延伸阶段。因此聚合酶离开启动子，进入延伸阶段。因此 TFIIH 能调节转录的延伸。能调节转录的延伸。 M

39、olecular BiologyMolecular Biology 74 因子 分子量KD功 能 RNA Pol 10 依赖模板合成RNA TFA 12,19,35 稳定TFD和DNA的结合，激活 TBP亚基 TFB 33 结合模板链(-10+10), 起始Pol 结合，和TFE/F相互作用 TFD (TBP,30) TBP亚基识别TATA,将聚合酶组入 复合体中,TAFs识别特殊启动子 TFE 34 () 57 ( 结合在Pol的前部，使复合体的 保护区延伸到下游 75 因子 分子量 KD 功能 TFF 38, 74 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小 亚基和Pol结合，介导其加入复合 体

40、 TFH 62,89 具激酶活性，可以磷酸化PolC端 的CTD，使Pol逸出，延伸 TFI 120 识别Inr，起始TFF/D结合 TFJ 在TFF后加入复合体，不改变 DNA的结合方式 TFS RNA合成延伸 转录起始复合物的组装转录起始复合物的组装 在在TFIIA协助下，协助下，TFIID上上TBP首先结合到启动子核心首先结合到启动子核心 元件元件TATA框上，形成动态的瞬时复合物框上，形成动态的瞬时复合物 TFIIB进一步结合到动态的瞬时复合物上进一步结合到动态的瞬时复合物上 TFIIF和和RNA聚合酶聚合酶II预先结合后，再结合到复合物上预先结合后，再结合到复合物上 TFIIE、TFIIJ和和TFIIH进入复合物，使之转变为有活进入复合物，使之转变为有活 性的转录起始复合物性的转录起始复合物 TFIIH的的DNA解旋酶活性利用解旋酶活性利用ATP，使起始位点解开，使起始位点解开 更多的更多的DNA双链，双链，TFIIH使使RNA聚合酶聚合酶IICTD磷酸化，磷