生物选修分离以尿素为氮源的微生物.

1、实验实验2 2 分离分离以尿素为氮以尿素为氮 源的源的微生物微生物 分离微生物的方法分离微生物的方法: : 平板划线分离法平板划线分离法 稀释平板分离法稀释平板分离法 选择培养基培养法选择培养基培养法 尿素又称脲尿素又称脲, ,是蛋白质的降解产物是蛋白质的降解产物, ,哺乳动哺乳动 物的尿液中含有物的尿液中含有, ,植物不能直接吸收尿素植物不能直接吸收尿素, , 因此因此, ,大量尿素的存在对环境造成污染大量尿素的存在对环境造成污染. .有有 些细菌可产生些细菌可产生脲酶脲酶, ,以尿素为氮源以尿素为氮源, ,脲酶可脲酶可 将尿素分解为氨将尿素分解为氨, ,被植物吸收被植物吸收. . 一、实验

2、原理一、实验原理 用选择培养基可分离出以尿素为氮源的微生物， 这些微生物可产生脲酶，脲酶可将尿素分解 为能被植物吸收的氨，因此这类微生物具有 一定的生态学价值。涂布分离法统计土壤样 品中含有的这种微生物的数目 细菌细菌 尿素尿素 NH3 中性中性 碱性碱性 酚红颜色酚红颜色： 黄色黄色 紫红色紫红色 二、实验目的二、实验目的: : 使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌( (有有 脲酶脲酶) ) 通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pHpH 的变化的变化( (脲酶催化的化学反应脲酶催化的化学反应) ) 统计被检测的土壤中

3、含有的以尿素为氮源的微生统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生 物的数量物的数量 三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题： （一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？ （选材的问题）（选材的问题） （二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？ （三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物 对尿素分解能力的高低？对尿素分解能力的高低？ （四）统计微生物的数量可用哪些方法？（四）统计微生物的数量可用哪些方法？ 没硬化，腐殖质丰富的

4、土壤没硬化，腐殖质丰富的土壤 碳源、尿素、无机盐、水、酚红碳源、尿素、无机盐、水、酚红 培养基红色的深浅培养基红色的深浅 涂布分离法，显微镜直接记数法涂布分离法，显微镜直接记数法 三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题： （五）用涂布分离法计数时，菌落数在（五）用涂布分离法计数时，菌落数在30-30030-300（2020 以内）计数。以内）计数。 重复性原则重复性原则 对照原则对照原则 （排除实验组中非测试因素对实验结果的 影响，提高实验的可信度） 做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度 （六）实验设计要遵循的原则：（六）实验设计要遵循的

5、原则： 两位同学分别用稀释涂布法测定同一土壤样品中的细菌数在两位同学分别用稀释涂布法测定同一土壤样品中的细菌数在 对应稀释倍数为对应稀释倍数为 的培养基中，得到以下两种统计结果 的培养基中，得到以下两种统计结果 第一个同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为第一个同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为 第二个同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分第二个同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分 别为、和。该同学以这三个平板上菌落数的别为、和。该同学以这三个平板上菌落数的 平均值作为统计结果。平均值作为统计结果。 你认为这两位的同学需要改进吗？如果需要，如何改进？你认为这两位的

6、同学需要改进吗？如果需要，如何改进？ 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，但是，其中第二位同学考虑到设置重复组的问题，但是，其中1 1个平板的计数结果与另个平板的计数结果与另 2 2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3 3 个平板的计数值用来求平均值个平板的计数值用来求平均值 。在设计实验时，一定要涂布至在设计实验时，一定要涂布至 少少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服

7、力与个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与 准确性准确性 两位同学分别用稀释涂布法测定两位同学分别用稀释涂布法测定同一土壤同一土壤样品中的样品中的 细菌数同学筛选出大约个菌落，但是，细菌数同学筛选出大约个菌落，但是， 同学在同样稀释度下只获得个菌落。同学在同样稀释度下只获得个菌落。 同学认为的结果有问题。他认为的培养基同学认为的结果有问题。他认为的培养基 可能被杂菌污染了，或在培养基中混入了其他含氮可能被杂菌污染了，或在培养基中混入了其他含氮 物质，导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中物质，导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中 生长。生长。 你能帮解决这个问题吗？你能帮解决这个问题吗？

8、 将将A A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行同学配制的培养基在不加土样的情况下进行 培养，作为空白培养，作为空白对照对照，以证明培养基是否受到污，以证明培养基是否受到污 染染 四、实验用品和材料：四、实验用品和材料： 五、操作步骤：五、操作步骤： 、倒平板：、倒平板： 、制备一定浓度梯度的细菌悬液：、制备一定浓度梯度的细菌悬液： g土壤ml无菌水，振荡，为-稀释液，依 次制备-、-、-的土壤稀释液。 、稀释涂布分离法分离细菌、稀释涂布分离法分离细菌 、制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基、制备无菌的固体培养基和尿素固体培养基 、培养观察（倒置，度）、培养观察（倒置，度） 倒个培养基，个尿

9、素固体培养基 （无菌，0.1ml，玻璃刮刀） 配制培养基 尿素培养基（1L） 葡萄糖 10g NaCl 4.8g K2HPO4 4.8g 琼脂 20g 酚红 0.01g 尿素 80g LB培养基（1L） 蛋白胨： 10g 酵母粉： 5g NaCl： 10g 琼脂： 20g 对照组对照组 选择培养基选择培养基 实验组实验组 倒平板 需要倒3个LB平板，9个尿素平板 每个稀释度每个稀释度 1个个LB对照平板对照平板 3个尿素平板个尿素平板(平行重复组平行重复组) 接种 取100ul菌悬液 涂布分离 涂布分离 涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？ 涂布平板的所有操作都应在火焰附近涂布平板的所有操作都应在火焰附近 进行。结合平板划线与系列稀释的无菌进行。结合平板划线与系列稀释的无菌 操作要求，想一想，取样时应如何进行操作要求，想一想，取样时应如何进行 无菌操作？无菌操作？ 应从操作的各个细节