激光扫描共焦显微镜2

1、激光扫描共焦显微镜技术的应用Confocal主要应用特点：o 形态学观察与检测：亚细胞器定位，如最简单的核定位 二维定位、定量 三维定位、图像重组o 生理学测量： 动态测量：实时检测 静态测量： 活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量(Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) （动态/静态） 自由基的检测（动态/静态） 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位（动态/静态）激光扫描共焦显微镜技术的应用u 活细胞内H+浓度(pH值)的测量（动态/静态）u 线粒体膜电位的测量（动态/静态）o 光谱测量o 蛋白质功能检测u 荧光漂白恢复（FRAP）的测量和FLIPu 荧光能量共振

2、转移(FRET)的测量(动态/静态）u 光活化和光转化检测o 其他应用激光扫描共焦显微镜技术的应用一、形态学观察与检测o 免疫荧光标记(单标、双标或三 标) 如：细胞膜受体、某种蛋白或酶的分布与表达，细胞骨架的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与亚细胞器的共定位、核转录因子转位、细胞的增值、分化o 细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位杂交-fitc + PI 8-氧脱氧鸟苷 激光扫描共焦显微镜技术的应用o 荧光原位杂交： 染色体基因定位o 单细胞凝胶电泳o GFP融合蛋白的表达o 蛋白的核转位荧光标记1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免疫荧光标记： 与抗体耦联, 直标

3、: 一抗+荧光探针 间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗体+荧光探针) TubulinTracker：Oregon Green 488 Taxol bis-acetate：紫衫醇 肌动蛋白actin ( Palloidine+荧光探针Tritc)2)细胞膜表面受体与胞内受体（活细胞）配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2) 标记 Gm1: 霍乱毒素受体： 霍乱毒素+FITC 标记 Ip3受体： HeparinFITC TfR受体：转铁蛋白TRITC 荧光染料的重要特性o 光谱特性:激发光谱和发射光谱o 光量子产率：特定条件下为

4、常数，每个染料分子的荧光强度与光量子产率成正比。o 摩尔吸光系数：代表染料对激发光的吸收能力o 光稳定性，光漂白性o PH稳定性o 特异性和毒性定位、定量研究中常用荧光探针 Green Red Far-Red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (异硫氰基荧光素) (四甲基异硫氰基罗丹明)Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 Cy5.5 532 (藻红蛋白) Cy7 633 Texas Red 595/615 350 (德州红) 405 Cy3 558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 54

5、3/569 BODIPY TR 592/618Alexa Fluor 染料o Alexa Fluor 染料 是一系列高亮度的卓越染料，他们的优点如下：o 亮度 Alexa Fluor 比相似发射光谱的染料的荧光更强。o 光稳定性 Alexa Fluor 比其他的荧光染料的光稳定性好，可更长时间采集图像o 颜色可选择性好 Alexa Fluor 提供从蓝色到红色不同的颜色可选择。o 强度不受PH 值影响 Alexa Fluor 在宽的PH值范围内有强荧光o 水溶性好 Alexa Fluor 染料的水溶性好，在细胞体系中可不使用有机溶剂，在储存中抗沉淀 Alexa Fluor 染料BODIPY 类

6、荧光染料p 对酸碱不敏感。o 荧光量子产率一般都比较高，有的甚至在水中的荧光量子产率可以接近1 0。o 具有相对较好的光稳定性。o 荧光光谱半峰宽较窄，作为荧光标识时有很好的灵敏度。o BODIPY 染料的摩尔吸光系数 很大，通常大于 80 000 L/( molcm) ，吸光效率比较高。BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618标记细胞器荧光探针1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子, 可检 测线粒体膜电位。 在多数正常细胞中停留时间长，在肿瘤细胞 中停留时间短。因此

7、，可用来研究肿瘤细胞的 多药抗药性。 JC1 线粒体膜电位低时为单体， 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体， 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针。MitoTracker probes 的光谱特性标记细胞器荧光探针Mitotracker 这类染料可被动扩散入胞内，染活细胞线粒体，在细胞固定和通透后，染料仍停留在细胞内，保留活细胞时的原样。可与GFP、免疫荧光等进行多重标记。o MitoFluor Green Probe 是 MitoTracker Green FM 的衍生物，可着染活细胞中的线粒体，固定后荧光不能保持。比罗丹明123的荧光强且光

8、稳定性好。红色的MitoFluor 荧光探针包括MitoFluor Red 589 、MitoFluor Red 594 MitoFluor Red 589 探针在线粒体聚集，且不受线粒体膜电位的影响。MitoFluor Red 594 probe是对线粒体膜电位敏感的染料。MitoSOX Red 线粒体过氧化的标记物 o MitoSOX Red 线粒体ROS探针 是一种高选择性的活细胞线粒体过氧化物检测的荧光染料。它可以通透活细胞并靶向线粒体。一旦在线粒体中被过氧化物氧化，发出明亮的红色荧光并与核酸结合。（激发/发射峰为510/580 nm ）MitoSOX Red 探针易于被过氧化物氧化，

9、但不能被其他ROS或氮自由基（RNS）产生系统氧化，并且氧化过程被超氧化物歧化酶所阻断。这种染料使研究者能够在活细胞的线粒体中直接测量其产生的过氧化物而不必分离线粒体。标记细胞器荧光探针2）溶酶体 Lysosome 中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官 为非特异性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞，固定和通透后，仍保持原样停留在细胞内。 LysoTracker Red DND-99 用于溶酶体损伤，细胞凋亡和受 体及通道蛋白的亚细胞地位的研究 Lysosensor 是一种嗜酸性的染料，其荧光强度随溶酶体酸性 的提高而

10、升高。用于测定溶酶体的PH值 标记细胞器荧光探针 3)高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramide 466/536, 可染活或死细胞 Bodipy FL C5-ceramide、Bodipy TR C5-ceramide Bodipy FL C5-神经酰胺的荧光特性有浓度依赖性。高浓度时，发射峰可从515nm变为620nm。多用于高尔基体染色。Bodipy FL C5-神经酰胺特异结合于高尔基体后，神经酰胺代谢为神经鞘磷脂，继而与其他膜 (主要是核膜和质膜) 结合。其他膜发绿色荧光，而高尔基体发红色荧光。 Bodipy FL C5-神经酰胺 Ex: Em 503nm

11、: 515nm标记细胞器荧光探针4)内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6(3) 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网, DiOC5(3) 较低浓度标记线粒体 ER blue white 360nm/430nm-640nm ER-Tracker Green and Red Dyes 540/587nm5)自噬体 autophagosome MDC 360nm/430nm以上激光扫描共焦显微镜技术的应用6)细胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死细胞碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA

12、/RNA 死细胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活细胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活细胞 560/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死细胞SYTO1116 2024 488/ 520 活细胞SYTO1116 2024 521/ 556 活细胞SYTO 17 621/634 活细胞荧光蛋白示踪绿色荧光蛋白不同种类的荧光蛋白n 蓝色荧光蛋白 BFPn 青色荧光蛋白 CFPn

13、绿色荧光蛋白 GFPn 黄色荧光蛋白 YFPn 红色 DsRed荧光蛋白主要应用o 对活细胞中的某种蛋白进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。o GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程o GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构o 可用于观察分子的运动（FRAP）o 蛋白之间的相互作用（FRET）在选择钙探针时应考虑的因素o 探针的形式 (盐, AM ester 甲基乙

14、酸酯或者葡聚糖结合物)探针的形式影响细胞负载的方式和探针在细胞内的分布和存留。盐和葡聚糖形式的探针用显微注射，微粒轰击或者电穿孔等方法进入细胞，而甲基乙酸酯有细胞膜通透性，可被动扩散进入细胞，在细胞内由酯酶裂解。o 测定方式：取决于离子浓度的定量还是定性的测定。探针在与离子结合后出现光谱转移的可用比值法测定钙离子的浓度 o 扩散系数 (Kd), 与所测定区域的钙浓度范围相当。探针的可测量的离子浓度范围在0.1 Kd 到 10 Kd之间。钙探针的 Kd 值受许多因素的影响，包括PH，温度，离子强度，蛋白质结合和是否存在镁离子和其它离子。测量细胞内钙变化的探针荧光探针 激发波长 发射波长 KdFL

15、uo3-AM 506nm 525nm 390nMFluo4 506nm 525nm345nMCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637nm 140nMOregon Green 488 494nm 520nm 20,000nMCalcium Crimso 583nm 602nm 328nMIndo-1 356nm 405/458nm 230nMFura-2 340/380 476nm 145nM检测线粒体钙的探针o Rhod-2，Rhod-5N，Rhod-FF，X

16、-rhod-1， X-rhod-5F，X-rhod-FF 。是一系列细胞通透的阳离子钙探针，在某些细胞中局限分布于线粒体，主要是通过电位驱动的膜摄取形成的。线粒体钙离子摄取能力强，因此需要低亲和性的钙探针来精确的测量其钙浓度。pH值的检测探针 膜电位的探针标记膜电位探针(慢反应）（每1mV 1%) ：JC1 （线粒体）510nm 530/590nmDioc5(3) 548nm 573nmDioc6(3) 484nm 500nm快反应探针(每100mV 210%) ：Di-4-ANEPPS 496nm 703nmDi-8-ANEPPS 498nm 713nm细胞膜静息膜电位：-70mV线粒体膜电

17、位：-150mV自由基的检测H2DCF-DA（504nm/529nm）2-氢，2氯荧光素乙酰乙酸盐：检测胞质内自由基水平 胞外H2DCF-DA 扩散入细胞内 酯酶脱乙酰DCF-H(不荧发光） DCF（发荧光）*样品不能在镜下用汞灯照射及观察Dihydroethidium(DHE)：胞浆内为蓝色，氧化后为红色，与DNA结合线粒体内自由基探针Dihydrorhodamine 123（507nm/529nm）被动扩散入细胞内 在细胞内被氧化成rodamine123（发光）MitoTracker Red CM-H2XRos ：（578/599 nm)被动扩散入细胞后，在胞浆内被氧化为一种发出红色荧光的

18、物质，并聚集在线粒体中，适于检测线粒体内自由基MitoSOX Red 线粒体ROS探针 ：（510/580 nm)是一种高选择性的活细胞线粒体过氧化物检测的荧光染料。它可以通透活细胞并靶向线粒体。在线粒体中被氧化，发出明亮的红色荧光并与核酸结合。肿瘤细胞的黏着斑蛋白和微丝（Actin)8氧鸟苷-fitc标记测定细胞凋亡Mitotracker 显示的293细胞的线粒体Lysotracker 显示的细胞内溶酶体MDC标记的细胞自噬体PC12细胞JC1测线粒体膜电位PC12细胞100mMGLU 处理后的线粒体膜电位DCFDA标记A549细胞的自由基变化NF-kB核转位激光扫描共焦显微镜技术的应用动态

19、测量 Physiology:细胞内离子动态变化测量o 游离Ca2+浓度变化的相对测量 检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右） 激光扫描共焦显微镜技术的应用o 测量过程1) 显微镜下找到合适的

20、细胞，最好用透射光寻找，避免汞灯的长时间照射。多数细胞在负载Fluo-3后荧光较稳定，但大鼠心肌细胞在汞灯长时间照射下荧光会增强，且细胞受到损伤。2) 确定采集图像的条件，包括针孔的大小、光电倍增管的增益、滤片系统的选择、扫描速度和扫描密度等，扫描速度和扫描密度要精心选择，它直接影响采样频率，即会影响测量结果。3) 根据细胞种类和所加的药物等实验要求，确定采集频率，即采集每一幅图像的间隔时间。当需要采样频率较高时，采集每一幅图像的时间间隔可设定为零，此时采样频率的快慢取决于扫描速度和扫描密度。如果仍然不能满足Ca2快速变化的要求，应加快扫描速度和减少扫描密度，或采用线扫描。然后根据扫描的总时程

21、，确定共需采集多少幅图像。4) 开始采集图像，加药前采集1分钟作为静息水平对照，加药后继续扫描。程序设定加药的等待时间。5) 采集图像之后或采集之前，勾画感兴趣的细胞或细胞内某个区域（核周、胞浆、胞核或突起等），计算机会描绘出时间荧光强度曲线。激光扫描共焦显微镜技术的应用激光扫描共焦显微镜技术的应用Ca2+浓度的绝对测量细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）1）标准曲线法根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度。2）比例荧光的测量.双波长(比

22、例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)Ca2+ I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2钙浓度的测定方法o Ca2+ I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2Kd：钙荧光探针的解离常数Rmin: 细胞内无钙时双发射荧光强度的比值( MnCl2)Rmax: 细胞内钙饱和时双发射荧光强度的比值(A23187)Ff2：细胞内无钙时分母的荧光强度Fs2：细胞内钙饱和时分母的荧光强度 检测Rmin时，在培养皿中需加入MnCl2 ，Mn2+ 可与Ca2+ 竞争结Fluo-3， Mn2+与Fluo-3结合后，

23、Fluo-3不发荧光，这时检测的荧光强度值相当于无Ca2+时的荧光强度。检测Rmax时，在培养皿中加入A23187或Triton X-100，使胞内Ca2+浓度与胞外Ca2+浓度平衡。通常按生理环境配置的胞外含Ca2+缓冲液的Ca2+浓度比胞内Ca2+高出1000倍以上。标准曲线法激光扫描共焦显微镜技术的应用快速Ca2+变化的测量1.改变扫描速度2.采用双向扫描3.减少采样点数(牺牲空间分辨率）4.采用线扫描(xt)样品制备o Ca2+负载所需材料和试剂： 培养在盖玻片或glass-bottom培养皿中（MatTek公司）融合程度达到70-80%的细胞。 Tyrodes盐溶液：5mM Hepe

24、s，136mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl2， 1.9mM CaCl2，5.6mM Glucose，用Tris调整pH值至7.4。 Tyrode-BSA: 加0.1%的BSA到Tyrodes盐溶液。 Hanks盐溶液。 使用渗透压计，测量含BSA和不含BSA缓冲液的渗透压，用蔗糖调渗透压至310mOsm。 将Fluo-3或其它Ca2+ 探针（Molecular Probes公司）溶于DMSO至1mM，制成冷冻储藏液，再溶于Tyrode-BSA溶液或Hanks盐溶液中，终浓度为5mM15mM。样品制备o 负载方法： 将细胞培养在盖薄片上或培养在glass-bottom培养皿中

25、的细胞用2ml Tyrodes盐溶液或Hanks盐溶液洗细胞三次。 取60-100ml Fluo-3置于glass-bottom培养皿的凹曹处，或将50-100ml Fluo-3置于盖薄片细胞表面上，用封口膜将液体展平，室温孵育45-60min，37C孵育30min（注意使细胞保释，处于生理状态）。 负载后，用Tyrode-BSA洗细胞两次，再用Tyrode洗细胞两次；或直接用Hanks液洗细胞三次。 将负载好的细胞再放置室温15min，以使酯酶充分水解激光扫描共焦显微镜技术的应用o 借助细胞内Ca2+的检测可研究：1肌肉的兴奋收缩-收缩偶联2神经递质的释放3学习记忆的增强4卵子受精5细胞分裂

26、和再生6细胞调亡7细胞间通讯8. 细胞膜受体的功能9. 细胞离子通道的功能10细胞信号传导11. DNA合成12. 基因表达PC12细胞钙变化线粒体内自由基的动态检测线粒体内自由基的动态检测药物进入细胞的过程转铁蛋白的运动肠系膜动静脉血流的动态观察光谱扫描的应用o 检测样品自发荧光的光谱o 新荧光探针的发射光谱o 在标记过程中造成的荧光探针的光谱转移o 光谱拆分：主要用于植物样品 激光扫描共焦显微镜技术的应用o 定位与定量测量应注意的问题定位：1.可以根据样品的实际情况，调整获取图像的参数。 以获取真实、清晰漂亮的照片为主。2.根据实际情况选择pinhole的大小，一般情况下应 尽可能小。3.

27、确认共定位时要取两个通道荧光相互干扰(crosstalk) 的对照图像，并采用补偿或顺序扫描的方法排除干扰。4.排除自发荧光、非特异性标记的影响，避免获取假 阳性信号图像。激光扫描共焦显微镜技术的应用定量(静态）：1. 仪器的各个条件必须一致(Pinhole、PMT、offset、laser、检测波长范围)。2. 必须用原始图像进行定量测量（不能用三维叠加图定量）。3. Pinhole尽可能的大。4. 尽可能采用两种荧光强度的比值或两个不同位 置的荧光强度比值。5. 无法用比值进行计算时，每次检测都必须有对照组， 且不同次的检测，对照组要一致。样品制备免疫荧光标记步骤1）免疫荧光单标记方法免疫

28、荧光单标记是指只标记一种蛋白分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题，但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下：o 所需材料与试剂： 培养在盖薄片或glass-bottom培养皿中（MatTek公司）汇合程度达到70-80%的细胞 一抗，二抗荧光素（FITC或TRITC） 4多聚甲醛固定液 封闭液 0.01M PBS缓冲液样品制备 取出培养有细胞的盖薄片或glass-bottom培养皿，PBS洗2-3遍 加入0.3的Triton X-100，37 C，30分钟 加入4多聚甲醛室温固定30分钟 正常羊血清封闭30分钟 加入一抗，3

29、7 C孵育1小时或4 C 过夜 0.3 Triton X-100洗5分钟；PBS（0.01）洗5分钟；0.3 Triton X-100洗5分钟；PBS（0.01M）洗5分钟 加入二抗FITC或二抗TRITC，37 C，孵育1小时 0.3 Triton X-100 洗5分钟，PBS（0.01M）洗5分钟；0.3 Triton X-100 洗5分钟，PBS（0.01M）洗5分钟，用滤纸吸干。 90甘油PBS封片。样品制备o 免疫荧光双标记免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白分子，方法稍微复杂一些，首先应注意两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠且尽量远离，通常可以选择二FITC和TRITC、Al

30、ex 488和TRITC、FITC和Cy5或Cy3和Cy5等来组合。染色时，通常情况下，两种一抗可以同时孵育，然后同时孵育两种二抗，但当染色结果一种颜色非常弱，而另一种颜色比较强时，应考虑先孵育颜色较弱的一抗且延长孵育时间。其它步骤同免疫荧光单标记。同时应注意两种一抗的种属来源不能相同。固定细胞核复染：Hochest33342：1mg/ml 15min 室温，洗2次。FRAP 应用o 荧光漂白恢复 (Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)o 测量淬灭区域的荧光恢复过程，从而得到分子运动的速率。o 主要用来检测生物膜流动性，细胞内细胞间分

31、子的流动，缝隙连接，分子的核浆穿梭等。FRAP 的测量原理o 细胞膜经荧光探针标记后，选择一个区域，用较强功率的激光进行照射，使被照射区发生光漂白或淬灭，然后测量被漂白区的荧光强度的恢复，按照下列公式可以计算出膜的侧向扩散系数D。 D= (3w2t1/2 ) g w: 光漂白区域的半径 t1/2: 荧光强度恢复到50%时所需的时间 g: 光漂白区域形状修正因子FRAP 常用染料细胞间缝隙连接通讯o 细胞间缝隙连接是细胞间微小的亲水性通道，可允许相对分子质量1000以下的小分子通过。这表明细胞内的小分子，如无机盐离子、糖、氨基酸、核苷酸和维生素等有可能通过间隙连接的孔膝，而蛋白质、核酸、多糖等生

32、物大分子不能通过。o 荧光漂白恢复技术可以研究细胞间缝隙连接，研究对象为活细胞，通常用荧光染料CDFA进行染色，荧光染料CDFA为可以穿过细胞间缝隙连接孔道的分子。测量时，将相邻两个细胞中的一个用较高功率的激光进行光漂白并测量光漂白后的荧光强度，然后测量该细胞的荧光恢复率R。FRAP 测定生物膜的流动性FRAP 测量生物膜的流动性FRAPFLIPo FLIP（Fluorescence loss in photobleaching) o 检测淬灭区域外的样品区域荧光减低的过程，间接表示出分子运动的快慢o 与FRAP的原理基本相同FRET(荧光共振能量转移）o FRET,荧光共振能量转移, 是在供体和受体相互