荧光定量PCR原理及应用科研

1、实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 荧光定量荧光定量PCR仪简介仪简介 实时荧光定量实时荧光定量PCR在科研上的应用在科研上的应用 实时荧光定量实时荧光定量PCR实验设计实例实验设计实例 实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：的原理： 什么是实时荧光定量PCR 荧光化学 双通道与内标 基因分型（SNP）检测 常规常规PCRPCR技术：技术： PCR后借助电泳对扩增反应的后借助电泳对扩增反应的终产终产 物物进行定量及进行定量及定性定性分析分析 DNA Engine S1 S2 M 常规常规电泳分析方法的缺点电泳分析方法的缺点 只能对终产物进行分析只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量无

2、法对起始模板准确定量 必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析,费时费事费时费事 无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测 EB有毒有毒 Opticon 定量定量PCRPCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应扩增反应 中中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过Ct值值 和标准曲线实现对和标准曲线实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析 实时荧光定量实时荧光定量PCR三个关键词：三个关键词： 实时，荧光，定量实时，荧光，定量 如何如何实时实时检测？检测？ 借助借助荧光荧光物质示踪扩增产物

3、量的变化物质示踪扩增产物量的变化 在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质， 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信 号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光 强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧 光强度变化实时监测产物量的变化 如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？ 通过通过Ct值值和标准曲线实现对和标准曲线实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析 引入两个概念：引入两个概念： 荧光阈值、荧光阈值、Ct值值 在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧 光强度标准光强度标准( (即即PCRPCR扩增产物量的标准扩增产物量的标准) ) Thr

4、eshold line C(t) value Ct值的定义是值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物 ( (荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环 次数次数 Threshold line C(t) value qLogLog浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性 关系关系 q初始初始 模板量越多模板量越多, , 扩增扩增 产物达到某一值（域值）产物达到某一值（域值） 时所需要的循环数越少时所需要的循环数越少 确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环

5、次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =N (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N. 方程式(1)两边同时取对数得: log N=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N (3) LogLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达 到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 定量原理：利用

6、已知起始拷贝数的标准样品作定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作 出标准曲线出标准曲线, ,通过未知样品的通过未知样品的CtCt值值, ,从标准曲线从标准曲线 上计算出该样品的起始浓度。上计算出该样品的起始浓度。 荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线 初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线 . 未知未知 104 103 106 105 102 10 unknown 104 103 Unknown contains 3108 copies 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置个值，它可

7、以设定在指数扩增阶段任意位置 上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-153-15 个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍倍 实时荧光定量实时荧光定量PCR方法利用方法利用CtCt的概念，的概念， 在指数扩增的开始阶段进行检测，此时在指数扩增的开始阶段进行检测，此时 样品间的细小误差尚未放大，因此该样品间的细小误差尚未放大，因此该CtCt 值具有极好的重复性。值具有极好的重复性。 相同模板在同一台相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复仪上相同条件下重复96次次 扩增的扩增曲线图扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；终点处检测

8、产物量不恒定；Ct值则极具重现性值则极具重现性 CtCt值的重现性值的重现性 实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：的原理： 什么是实时荧光定量PCR 荧光化学 双通道与内标 基因分型（SNP）检测 示踪扩增产物量变化的示踪扩增产物量变化的荧光物质荧光物质及及 其其工作原理工作原理 qSYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 qSYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧 光。 G T T T G G C C C CC C C A A A G G G A C T T G A T A G C A T C G T A A Bound SYBR Green I Unboun

9、d SYBR Green I PCR q使用方便 - 不必设计复杂的荧光探针 q没有序列特异性 - 可以用于不同的模板 q便宜 q灵敏 q与非特异性产物结合与非特异性产物结合 Temperature increases Fluorescence decreases Tm -dI dT Tm Identical reaction components, except initial template concentration varies 10,000 copies Non-specific product Amplicon Amplicon10 copies 10,000 copies 10

10、 copies 0 copies Melting curve resultsAmplification results 1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. 63oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. Plate Read 6. 84oC for 1 sec 7. Plate Read 8. Go to line 2 39 more times 9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec. 10,000 copies 10 copie

11、s 0 copies Melting curve resultsAmplification results 1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. 63oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. Plate Read 6. 84oC for 1 sec 7. Plate Read 8. Go to line 2 39 more times 9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec. For reliable nucleic acid qu

12、antification, each primer set requires individual optimization Parameters used to optimize reaction specificity and efficiency Primer design Amplicon design Concentration of reagents Cycling conditions Denaturation and annealing temperatures Dynamic thermal gradient allows for one-step reaction- tem

13、perature optimization Up to 24oC gradient range 45oC 55oC 65oC Melting curve resultsAmplification results 1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. 83oC for 1 sec 6. Plate Read 7. Go to line 2 39 more times 8. Melting curve from 65oC to 95oC

14、, read every 0.2oC, hold 1 sec. q起始模板浓度定量 q融解曲线分析 -可区分单一产物、变异产物、多种产 物和（或）引物二聚体 q基因型分析 发夹型杂交探针发夹型杂交探针 原理：荧光谐振能量传递（原理：荧光谐振能量传递（FRET） 茎由互补配对的序列组成茎由互补配对的序列组成 环与目标序列完全配对环与目标序列完全配对 茎茎 荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂 环环 T A C C G GG G G T T A C G A A C GG T A A T T A C C G GG G G T T A C G A A C GG T A A T Target-loop intera

15、ction more stable than stem- stem T A C C G GG G G T T A C GA A C G G T A A T T T T T G CC C C C A A A A Q R Target q定量起始模板浓度定量起始模板浓度 q基因型分析基因型分析 q鉴定产物鉴定产物 q单核苷酸单核苷酸多态性（多态性（SNP）检测）检测 T A C C G GG G G T T A CG A A C G G T A A T T T T T G CC C C C A A A A Q 荧光素 目标序列 茎 淬灭剂 q对目标序列有很高的特异性对目标序列有很高的特异性 用于用

16、于SNPSNP检测的最灵敏的试剂之一检测的最灵敏的试剂之一 q荧光背景低荧光背景低 q设计困难设计困难 q无终点分析功能无终点分析功能 q只能用于一个特定的目标只能用于一个特定的目标 q价格较高价格较高 探针探针 荧光素荧光素 淬灭剂淬灭剂 水解型杂交探针水解型杂交探针 q目标特异性探针 q5 为荧光素， 3 为淬灭剂 5 荧光素3淬灭剂 与目标序列互补 R Q Reporter Quencher RQ Intact probe - reporter quenched by FRET F R RQ During PCR, probe hybridizes to target sequence

17、R Q Probe is partially displaced during extension R Q Probe cleaved by 5- 3 nuclease activity of polymerase R Q Free reporter exhibits unquenched fluorescence q定量起始模板浓度定量起始模板浓度 q基因型分析基因型分析 q产物鉴定产物鉴定 qSNPSNP分析分析 q对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测 q与 Molecular Beacons 相比设计相 对简单 q价格较高 q只适合于一个特定的目标 q不能进行融解曲线分析 q

18、背景高 结合于双链结合于双链 DNA的小沟的小沟 中中 发夹型杂交探发夹型杂交探 针针 水解型杂交探水解型杂交探 针（针（5-3外外 切）切） 延伸延伸 复性复性 任何任何 步骤步骤 定量和检测目标基因定量和检测目标基因 融解曲线分析融解曲线分析 SNP分析分析 定量和检测目标基因定量和检测目标基因 SNP分析分析 定量和检测目标基因定量和检测目标基因 信号检测信号检测 工作原理工作原理 有否淬灭剂有否淬灭剂化学试剂化学试剂 否否 有有 有有 主要应用范围主要应用范围 实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：的原理： 什么是实时荧光定量PCR 荧光化学 双通道与内标 基因分型（SNP）检测 双通

19、道与内标双通道与内标 准确的相对定量方法准确的相对定量方法-内标法内标法 -解决模板提取过程中造成的差别解决模板提取过程中造成的差别 -解决样品材料不均一造成的差别解决样品材料不均一造成的差别 -解决加样过程中的差别解决加样过程中的差别 内标法必须：内标法必须：在一个在一个PCRPCR管中进行两种管中进行两种 PCRPCR反应：反应： q一个是有差别的（目标一个是有差别的（目标RNA或或DNA） q一个是无差别的（内标一个是无差别的（内标RNA或或DNA） q内标的种类内标的种类 1.看家基因看家基因 2.添加添加DNA或或RNA 多色双通道技术：多色双通道技术： q多色：可使用多种荧光染料多

20、色：可使用多种荧光染料 q双通道：可同时测定两种荧光染料双通道：可同时测定两种荧光染料 发出的荧光发出的荧光 一个一个PCRPCR管内进行两种管内进行两种PCRPCR扩增要解决的问扩增要解决的问 题：题： 1 1、引物及探针问题、引物及探针问题-引物及探针的相引物及探针的相 互干扰互干扰 2 2、模板量差别、模板量差别-共用资源的相互竞争共用资源的相互竞争 F R RQ F R RQ F R RQ R Q 1、引物及探针问题、引物及探针问题 F R RQ F R RQ R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q

21、 R Q R Q R Q R Q 2、共用资、共用资 源的相互竞争源的相互竞争 F R RQ F R RQ R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q 解决办法：解决办法：单双通道同时进行，相互验证单双通道同时进行，相互验证 单单单单 双双 解决办法之二：解决办法之二：primer limiting 实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：的原理： 什么是实时荧光定量PCR 荧光化学 双通道与内标 基因分型（SNP）检测 F R FQ C VQ T C SNP G/A FQ C VQ T Forward prim

22、er Reverse primer Allele-specific probe Allele-specific probe 用用TaqManTaqMan探针进行基因型分析探针进行基因型分析 Q F 5 C G Q 5 3 G C FQ V 5 3 G T Q 5 3 Hybridization of TaqMan Probe Digestion of probe - fluorescenceNO digestion of probe - NO fluorescence T VQ C FQ Match for Allele 1 Reduced Efficiency of Probe Hybrid

23、ization Mismatch for Allele 1 Polymerase q 从病人血液样品中提取 DNA q 基因型分类： qA/A (Allele 1) qG/G (Allele 2) qG/A (Heterozygote) C FQ T VQ Allele 1 control VIC FAM Allele 2 control VIC FAM Heterozygote control FAM VIC SampleFAMVICGenotype 121.8022.70G/A 2N/A20.00A/A 321.2022.70G/A 4N/A21.10A/A 5N/A21.40A/A 6N

24、/A20.67A/A SNPSNP的网站的网站 dbSNP(/SNP/):dbSNP(/SNP/):该网站是由美国该网站是由美国 的的NCBINCBI主办的。它除了可接受各地发来的主办的。它除了可接受各地发来的SNPSNP申请注册外，申请注册外， 也向公众免费提供对也向公众免费提供对SNPSNP的查询。的查询。 (2) (2) HGBASE(eractiva.de):HGBASE(eractiva.de):该网站建在德国，该网站

25、建在德国， 收集基因内收集基因内SNPSNP，研究者可通过检测出的序列查询研究者可通过检测出的序列查询SNPSNP。 (3) MIT SNP(3) MIT SNP数据库数据库 ( (/SNP/human/index.html):/SNP/human/index.html):该该 网站是由美国麻省理工学院建立的。它包括数千条已经定位网站是由美国麻省理工学院建立的。它包括数千条已经定位 的的SNPSNP，可以通过指定染色体的某一区域查询可以通过指定染色体的某一区域查询SNPSNP。 其它的其它的

26、SNPSNP站点还有：华盛顿大学，网址是：站点还有：华盛顿大学，网址是： /SNP/SNP; ; CHLC,CHLC,网址是：网址是：/cgap/nature-/cgap/nature- genetics-snps.html;genetics-snps.html; 美国人类基因组研究所，网址是：美国人类基因组研究所，网址是： /About-/

27、About- NHGRI/Der/variat.htmNHGRI/Der/variat.htm。 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 荧光定量荧光定量PCR仪简介仪简介 实时荧光定量实时荧光定量PCR在科研上的应用在科研上的应用 实时荧光定量实时荧光定量PCR实验设计实例实验设计实例 生产商：美国生产商：美国MJ Research 公司公司 Chromo4 Four-Color Real-Time Detector q循环仪循环仪 q检测系统检测系统 q计算机及软件系统计算机及软件系统 PTC200PTC200 q加热加热: :电热丝电热丝+ + 半导体半导体 q制冷制冷: :半导体半导体

28、 样品模块样品模块 Peltier 模块模块 散热槽散热槽 风扇风扇 电阻丝电阻丝 的的PCRPCR仪结构：仪结构： q三传感器三传感器 q双区域温度双区域温度 - -温度梯度温度梯度 光源光源 光学光学 元件元件 反反应管应管 光学光学 元件元件 热循环仪热循环仪 检测检测 优势优势 q寿命长寿命长 q稳定稳定 q体积小体积小 q产热少产热少 q可过夜运行可过夜运行 发光二极管（发光二极管（LED） 优势优势 q灵敏灵敏 q检测范围广检测范围广 q体积小体积小 q耐用耐用 光电二极管通过吸收光子产生光电二极管通过吸收光子产生 电流电流 q多色四通道多色四通道 q四组四组LEDLED、滤镜和滤

29、镜和PDTPDT q组成光学检测模块组成光学检测模块 q4 4个个LEDLED依次发光，消除依次发光，消除 q孔间干扰孔间干扰 q检测模式为扫描型，检测模式为扫描型， 11 11 q秒扫过秒扫过9696个样品个样品 q扫描头离样品距离近，扫描头离样品距离近， q提高检测的灵敏度提高检测的灵敏度。 用用VICVIC标记的标记的-actin-actin连续连续1010倍稀释标准品定量结果倍稀释标准品定量结果 q 可以清晰的分辨出 128、256、512、 1024拷贝数的初始 模板量 q 无论使用哪一个通道，无论使用非特异性的SG1 或特 异性的TaqMan 探针，都能得到重复性极好的结果 实验时

30、间：实验时间： 2002年8月16日 地点：地点： 北京红十字血液 中心 试剂：试剂： PG公司 HIV及 HCV试剂盒 样本：样本： 血液中心-20度 保存 实验时间：实验时间： 2002年8月14日 地点：地点： 北京红十字血液 中心 试剂：试剂： PG公司 HIV试 剂盒 样本：样本： 血液中心-20度 保存 实验时间：实验时间： 2002年8月21日 地点：地点： 北京大学生命科 学学院 试剂：试剂： PG公司 HBV试 剂盒 样本：样本： 参控标准品 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 荧光定量荧光定量PCR仪简介仪简介 实时荧光定量实时荧光定量PCR在科研上的应用在科研上的应用

31、 实时荧光定量实时荧光定量PCR实验设计实例实验设计实例 定量：定量： qDNA定量定量 qRNA定量定量 定性：定性： qSNP分析分析 q基因型分析基因型分析 qRNA变异分析变异分析 q融解曲线分析融解曲线分析 临床定量研究的应用：临床定量研究的应用： 1. 1.病原微生物引起的疾病的检测病原微生物引起的疾病的检测 2.2. 病原微生物含量与病情的轻重程度、传染性及治疗效病原微生物含量与病情的轻重程度、传染性及治疗效 果之间的关系果之间的关系 3.3. 新的治疗与预后指标的研究新的治疗与预后指标的研究 4.4. 病原微生物含量与用药之间的关系病原微生物含量与用药之间的关系 5.5. 新的

32、病原体分子诊断标准新的病原体分子诊断标准 6.6. 超早期感染治疗用药物及疗法的研究与开发超早期感染治疗用药物及疗法的研究与开发 7.7. 在传染病流行病学方面的应用在传染病流行病学方面的应用 ：医院血站防疫站：医院血站防疫站 8.8. 传染病的发病监控、预测与预防传染病的发病监控、预测与预防 9. mRNA9. mRNA的表达水平与是否肿瘤及其进展的的表达水平与是否肿瘤及其进展的 关系关系 10.10.肿瘤相关基因表、肿瘤标志物肿瘤相关基因表、肿瘤标志物 和肿瘤耐药基因和肿瘤耐药基因 的检测的检测 11. 11. mRNAmRNA的表达水平与染病及病情之间的关的表达水平与染病及病情之间的关

33、系：预测系：预测 、诊断、评价、指导治疗、诊断、评价、指导治疗 临床定性检测临床定性检测( (SNP)SNP)的应用：的应用： 1. 1.等位基因与遗传病之间的关系等位基因与遗传病之间的关系 2.诊断诊断及及预测预测致病致病风险风险 3. 3. SNPSNP与体质遗传病之间的关系与体质遗传病之间的关系 4.4.药药物基因物基因组学组学及新及新药药的的发现发现 5.5.合理用药合理用药研究研究 其他：其他： 1. 1. 比较染病组织与正常组织中各种比较染病组织与正常组织中各种mRNAmRNA含量差异含量差异 2.2. 病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定HBV

34、HBV基因突变，基因突变， 尤其是前核基因突变，直接影响尤其是前核基因突变，直接影响HBVHBV感染病情转归及抗毒治疗效果，同时也反映了来自体内或外界感染病情转归及抗毒治疗效果，同时也反映了来自体内或外界 选择压力的作用。因此，突变株在体内产生的确切原因，突变株与野生株混合存在的发展趋向，选择压力的作用。因此，突变株在体内产生的确切原因，突变株与野生株混合存在的发展趋向， 突变株是否为耐药株，突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关系，突变株与免疫耐受的关突变株是否为耐药株，突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关系，突变株与免疫耐受的关 系等均是有必要进一步澄清的问题。系等均是有必要进一步澄

35、清的问题。 3.3. 新临床诊断及检验试剂的开发新临床诊断及检验试剂的开发 4.4. 研究研究ELISAELISA方法的漏检率方法的漏检率 5.5. HLAHLA分型分型：取代传统电泳方法取代传统电泳方法 6. 遗传病诊断遗传病诊断 ：如地中海贫血如地中海贫血 等位基因检测等位基因检测 多基因遗传病的突变检测多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测基因表达异常所致遗传病检测 胚胎胚胎植入前遗传诊断植入前遗传诊断（preimplantation genetic preimplantation genetic diagnosisdiagnosis，PGDPGD）是用人类辅助生殖技术获得受

36、精卵，是用人类辅助生殖技术获得受精卵，体外培养发育到体外培养发育到 6 61010细胞的卵裂球时，通过显微操作技术从中活检细胞的卵裂球时，通过显微操作技术从中活检1 12 2个单细胞，利用个单细胞，利用 医学分子遗传学诊断技术对单个卵裂球细胞标本进行遗传诊断，然后将医学分子遗传学诊断技术对单个卵裂球细胞标本进行遗传诊断，然后将 它们移植回母体子宫内继续发育至妊娠，从而避免遗传病患儿出生。遗它们移植回母体子宫内继续发育至妊娠，从而避免遗传病患儿出生。遗 传病基因携带夫妇如不想用产前诊断、人工流产来避免高危受累患儿的传病基因携带夫妇如不想用产前诊断、人工流产来避免高危受累患儿的 出生，出生，PGD

37、PGD目前是他们的唯一选择。与以前采用的巢式目前是他们的唯一选择。与以前采用的巢式PCRPCR相比，相比，FQPCRFQPCR减减 少了等位基因缺失（少了等位基因缺失（allele drop-outallele drop-out，ADOADO）现象的发生。现象的发生。 其他方面的部分应用：其他方面的部分应用： q公安系统相关公安系统相关 ： 个人身份鉴定个人身份鉴定 物证的各种鉴定物证的各种鉴定 人种的鉴定人种的鉴定 q考古方面考古方面 q动植物检疫动植物检疫 研究方面部分应用研究方面部分应用 基因表达分析：基因表达分析： q物种分类物种分类 q环境污染与毒理监测：生物标志物的定量环境污染与毒

38、理监测：生物标志物的定量 检测检测 q基因芯片结果的复证基因芯片结果的复证 q分子生态学研究分子生态学研究 qGenotyping 转基因研究方面的部分应用：转基因研究方面的部分应用： 转基因的基因拷贝数与受体生物性状之间的关系；转基因的基因拷贝数与受体生物性状之间的关系； 转基因的基因表达量与受体生物性状之间的关系；转基因的基因表达量与受体生物性状之间的关系； 转基因胚胎中转基因拷贝数的测定；转基因胚胎中转基因拷贝数的测定； 转基因对受体生物其他基因表达的影响（包括不转基因对受体生物其他基因表达的影响（包括不 同的发育时期的影响）；同的发育时期的影响）； 转基因生物安全方面的部分研究：转基因

39、生物安全方面的部分研究： 转基因在环境中的扩散监测；转基因在环境中的扩散监测； 转基因生物世代传递中的拷贝数、表达量转基因生物世代传递中的拷贝数、表达量 变化监测变化监测 食品、烟草、化妆品等中转基因成份含量食品、烟草、化妆品等中转基因成份含量 的测定的测定 （GMO)GMO) 转基因成分含量与毒理代谢之间的关系转基因成分含量与毒理代谢之间的关系 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 荧光定量荧光定量PCR仪简介仪简介 实时荧光定量实时荧光定量PCR在科研上的应用在科研上的应用 实时荧光定量实时荧光定量PCR实验设计实例实验设计实例 应用实例之应用实例之 Outline probes 应用实

40、例之应用实例之 应用实例之应用实例之 应用实例之应用实例之 应用实例之应用实例之 q从从 正常乳腺组织中提取的正常乳腺组织中提取的 Total RNA Total RNA q从乳腺癌组织中提取的从乳腺癌组织中提取的 Total RNA Total RNA q含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准的质粒用于生成标准 曲线曲线 q单双通道同时进行，独立分析单双通道同时进行，独立分析 Multiplex RT-qPCR reaction components ComponentStock concentration volumeFinal conce

41、ntration RNA Target Primer/probe mix GAPHD Primer/probe mix QuantiTect Probe RT-PCR mix Reverse transcriptase ddH2O 1ng/ul 20X 20X 2X 2.0ul 0.5ul 0.5ul 10.0ul 0.2ul 6.8ul 0.5X 0.5X 1X Total volume20ul RT-qPCR program 1,50C,30min 2,95C,15min 3,94C,15sec 4,60C,1min 5,plate read 6,go to step 3,39 more

42、times 7,10C,forever End 应用实例之应用实例之 Color 2 - VIC detection for GAPDH Color 1 FAM detection for ERBB2 CH1-FAM detection- ERBB2CH2-VIC detection- GAPDH ERBB2ERBB2单双通道相互验证的实验结果单双通道相互验证的实验结果 A.Multiplex Reactions Healthy RNACarcinoma 28.4826.42 28.6826.98 28.7826.98 28.65 0.1526.80 0.32 B.Singleplex rea

43、ctions Healthy RNACarcinoma 28.6727.09 28.7126.68 28.7326.70 28.70 0.0326.82 0.24 Healthy RNA Tumor RNA GAPDH ERBB2 1095 1052 2130 2492 95500 85730 136000 130800 2.16 X 1.45 X Copies ng/ l Total RNA ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800

44、 = 0.019 Healthy RNA Tumor RNA 0.0115 0.018 0.011 / 0.018 Graph Copies ng/ l Total RNA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 Healthy Tissue Carc. Tissue Relative Expression ERBB2的表达差异 利用利用RT-qPCR在在Opticon2上成功检测上成功检测 了了ERBB2基因在不同组织的基因在不同组织的 表达差异；表达差异； 在乳腺癌组织中，在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量提的表达量提 高到正常水平的高到正常水平的1.8

45、倍倍 应用实例之应用实例之 用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列分子量换算成拷贝数，做系列 稀释稀释 Opticon Reference Papers 1.L. Shively, L.Chang, J.M. LeBon, Q.Liu. A.D. Riggs, and J. Singer-Sam. Real-T

46、ime PCR Assay for Quantitative Mismatch Detection. BioTechniques, March 2003, Vol. 34, No. 3. (Mismatch detection) 2.F. Grun, R. N. Vankatesan, M. M. Tabb, C. Zhou, J. Cao, D. Hemmati, B. Blumberg. Benzoate X Receptors a and Are Pharmacologically Distinct and Do Not Function as Xenobiotic Receptors.

47、 The Journal of Biological Chemistry. Issue of November 15, Volume 277, No.46, pp. 43691-43697, 2002. (RT-PCR, SYBR Green) 3.K. Decker, T. Trager, A. Missel, K. Heitz, S. Kobsch, K. Machura, D. Loffert. Optimizing Probe Hybridization in Real-Time PCR for Quantification and SNP Genotyping. Qiagen New

48、s, Issue 4, pp. 13-16, 2002. (SNP Genotyping) 4.N. Qi, L. Kazdova, V. Zidek, V. Landa, V. Kren, H. A. Pershadsingh, E. St. Lezin, N. A. Abumrad, M. Pravenac, T. W. Kurtz. Pharmacogenetic Evidence That Cd36 Is a Key Determinant of the Metabolic Effects of Pioglitazone. The Journal of Biological Chemi

49、stry. Issue of December 13, Volume 277, No. 50, pp. 48501-48507, 2002. (Gene Expression) 5.L. Wu, Y. Wu, B. Gathings, M. Wan, X. Li, W. Grizzle, Z. Liu, C. Lu, Z. Mao, x. Cao. Smad4 As A Transcription Corepressor for Estrogen Receptor a . JBC Papers In Press, Published on February7, 2003 as Manuscri

50、pt M212332200. (Chromatin PPT.) 6. L. Qin, P. Qiu, L. Wang, X. Li, J. T. Swarthout, P. Soteropoulos, N. C. Partridge. Gene Expression Profiles and Transcription Factors Involved in PTH Signalling in Osteoblasts Revealed by MicroArray and BioInformatics. JBC Papers in Press. Published on March 18, 20

51、03 as Manuscript M212226200. (Gene Expression and Microarray validation) 7. J. Van Ness, L. K. Van Ness, D. Galas. Isothermal Reactions for the Amplification of Oligonucleotides. Proceedings of the Natl. Academy of Sciences. USA, 10.1073/pnas.0730811100 (published online before print) (Isothermal Re

52、actions) 8. X. Zhao, T. D. Gallardo, L. Lin, J. J. Schageman, R. V. Shohet. Transcriptional Mapping and Genomic Analysis of the Cardiac Atria and Ventricles. Physiol.Genomics 12:53 60, 2002; 10.1152/physiolgenomics.00086.2002. ( Microarray validation) 9. N. Selvamurugan, Z. Fung, N. C. Partidge. Transcritional Activation of Collagenase-3 by Transforming Growth Factor-Li Is Via MAPK and