《酶与细胞的固定化》

1、1 第五章第五章 酶与细胞的固定化酶与细胞的固定化 一、酶与细胞的固定化一、酶与细胞的固定化 二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 三、固定化酶和固定化细胞的应用三、固定化酶和固定化细胞的应用 2 第五章第五章 酶与细胞的固定化酶与细胞的固定化 一、酶与细胞的固定化一、酶与细胞的固定化 酶作为工业催化剂存在的缺陷：酶作为工业催化剂存在的缺陷： 1 1）稳定性差）稳定性差 2 2）分离纯化困难）分离纯化困难 3 3）回收困难）回收困难 3 （一）固定化酶和固定化细胞的定义（一）固定化酶和固定化细胞的定义 1 1、固定化酶、固定化酶 固定化酶固定化酶( (imm

2、obilized enzyme) )概念：概念：P P220 220 优缺点：优缺点：P P220 220 2 2、固定化细胞固定化细胞 概念：概念：P P221 221 优缺点：优缺点：P P221 221 4 水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体 固定化技术固定化技术 水不溶性酶水不溶性酶 （固定化酶）（固定化酶） 什么是固定化酶？ 5 柱式酶反应器工作原理示意图柱式酶反应器工作原理示意图 6 （二）酶和细胞固定化方法（二）酶和细胞固定化方法 1 1、酶的固定化、酶的固定化 （1 1）一般方法及特点一般方法及特点 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。关键在于选

3、择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。 1 1）三大类方法（或四大类方法）：）三大类方法（或四大类方法）： 载体结合法载体结合法 吸附法（包括电吸附法）、结合法（无机多孔材料）吸附法（包括电吸附法）、结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂）交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）包埋法（微胶囊法） 7 2 2）选择方法依据：）选择方法依据： a a、酶的性质。酶的性质。 b b、载体的性质。载体的性质。 c c、制备方法的选择。制备方法的选择。 3 3）固定化后酶的考察项目：固定化后酶的考察项目： a a、测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。测定固定化酶的活力，

4、以确定固定化过程的活力回收率。 b b、考察固定化酶稳定性。考察固定化酶稳定性。 c c、考察固定化酶最适反应条件。考察固定化酶最适反应条件。 8 （2 2）酶的固定化方法）酶的固定化方法 1 1）载体结合法）载体结合法 概念：概念：P P222 222 a a、物理吸附法物理吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在载体载体表面上。表面上。选择载选择载 体的原则体的原则: :（a a）要有巨大的比表面积要有巨大的比表面积; ;（b b） 要有活泼的表面要有活泼的表面; ;（c c） 便于装柱进便于装柱进 行连续反应。常见载体有无机载体（高岭土、硅胶、

5、氧化铝、多孔玻璃、活性碳、行连续反应。常见载体有无机载体（高岭土、硅胶、氧化铝、多孔玻璃、活性碳、 羟基磷灰石等），有机载体（纤维素、胶原、大孔合成树脂、陶瓷、海藻酸钠羟基磷灰石等），有机载体（纤维素、胶原、大孔合成树脂、陶瓷、海藻酸钠CACA 等）。等）。相对于有机载体，无机载体材料大多成本低、使用寿命长、机械强度高和相对于有机载体，无机载体材料大多成本低、使用寿命长、机械强度高和 耐酸碱等特性而更具实用性。耐酸碱等特性而更具实用性。 b b、离子结合法离子结合法 也称离子交换吸附法。常见载体有阴离子交换剂（也称离子交换吸附法。常见载体有阴离子交换剂（DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、 D

6、EAE-DEAE-葡聚糖凝胶等），阳离子交换剂（葡聚糖凝胶等），阳离子交换剂（CM-CM-纤维素等）。使用中必须注意：纤维素等）。使用中必须注意：pHpH、 离子强度、温度。离子强度、温度。 c c、共价结合法共价结合法 可以形成共价键的基团：游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、可以形成共价键的基团：游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、 酚基、羟基、甲硫基、吲哚基和二硫键等。常见载体有天然高分子衍生物（纤维酚基、羟基、甲硫基、吲哚基和二硫键等。常见载体有天然高分子衍生物（纤维 素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等），人工合成的高聚物（聚丙烯酰胺素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等），人工合成的高聚物（聚丙烯酰胺PAMPA

7、M、聚苯乙烯、聚苯乙烯、 聚乙烯醇聚乙烯醇PVAPVA、尼龙等），无机载体（多孔玻璃等）。尼龙等），无机载体（多孔玻璃等）。 9 酶和细胞固定化模式图酶和细胞固定化模式图 10 c c、共价结合法共价结合法 载体活化的方法有重氮法、叠氮法、载体活化的方法有重氮法、叠氮法、烷基化反应法烷基化反应法、硅硅 烷化法、溴化氰法等。烷化法、溴化氰法等。 重氮法重氮法 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSEABSE） 纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等。该方法需要载体具有芳香族纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等。该方法需要载体具有芳香族 氨

8、基。氨基。 11 叠氮法叠氮法 对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体， 再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。包括酯化、再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。包括酯化、 肼解、肼解、 叠氮化、偶联等步骤。叠氮化、偶联等步骤。 12 烷基化反应法烷基化反应法 含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形 成含有卤素基团的活化载体。成含有卤素基团的活化载体。 硅烷化法硅烷化法 常用的载体：多孔玻常用的载体：多孔玻 璃，多孔陶瓷。璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特点：多孔玻璃特点：

9、 机械强度好，表面积大。耐有机机械强度好，表面积大。耐有机 溶剂和微生物破坏。载体可以再生，溶剂和微生物破坏。载体可以再生， 寿命长等。寿命长等。 13 溴化氰法溴化氰法 本方法主要用溴化氰（本方法主要用溴化氰（CNBrCNBr）活化多糖类物质。如纤活化多糖类物质。如纤 维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔 网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使 用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。 14 2 2）

10、交联法）交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的 固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常见的功能团：常见的功能团：N N末端氨基、末端氨基、LysLys氨基、氨基、TyrTyr酚基、酚基、CysCys巯基、巯基、HisHis咪唑基等。咪唑基等。 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N N，NN乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。 应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨

11、基形应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形 成席夫碱成席夫碱( (shiff)shiff)。 交联法有交联法有2 2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。 酶直接交联法酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pHpH和离子强度、温度和反应时间之间和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。的平衡。 酶辅助蛋白交联法酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引：为避免分子内交联和在

12、交联过程中因化学修饰而引 起酶失活，可使用第二个起酶失活，可使用第二个 载体载体 蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明 胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。 分子内交联：多数发生于低的酶浓度，交联后酶通常仍保持溶解状态。分子内交联：多数发生于低的酶浓度，交联后酶通常仍保持溶解状态。 分子间交联：发生于较高酶浓度下，交联后酶通常保持不溶解状态。分子间交联：发生于较高酶浓度下，交联后酶通常保持不溶解状态。 15 3 3）包埋法）包埋法 将聚合物的单体和酶溶液混合后，借助聚合促进剂（如交联

13、将聚合物的单体和酶溶液混合后，借助聚合促进剂（如交联 剂）的作用使单体进行聚合，从而将酶包埋于聚合物中的固定化方法。剂）的作用使单体进行聚合，从而将酶包埋于聚合物中的固定化方法。 网格型包埋法网格型包埋法：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形 状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝 胶（胶（PAMPAM）、）、聚乙烯醇（聚乙烯醇（PVAPVA）以及天然高分子化合物等。以及天然高分子化合物等。 微囊型包埋法微囊型包埋法：是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小

14、球内，制成是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成 固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米， 所以也称为微囊化法。所以也称为微囊化法。 网格型包埋法网格型包埋法 微囊型包埋法微囊型包埋法 16 固定化方法固定化方法 载体结合法载体结合法 交联法交联法 包埋法包埋法 物理吸附法物理吸附法 离子结合法离子结合法 共价结合法共价结合法 制备难易制备难易 易易 易易 难难 结合程度结合程度 弱弱 中等中等 强强 酶活回收率酶活回收率 高，但酶易流失高，但酶易流失 高高 低低 对底物专一性对底物专一性 不变不变 不

15、变不变 可变可变 再再 生生 可能可能 可能可能 不可能不可能 固定化费用固定化费用 低低 低低 高高 较难较难 较难较难 强强 强强 中等中等 高高 可变可变 不变不变 不可能不可能 不可能不可能 中等中等 低低 （3 3）各种固定化酶方法的优缺点比较）各种固定化酶方法的优缺点比较 表表5.1 5.1 酶的各种固定化方法的比较酶的各种固定化方法的比较 17 举例海藻酸钙包埋法举例海藻酸钙包埋法 称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一 定体积的酶液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴定体积的酶液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液

16、滴 入一定浓度的凝固浴中（常用入一定浓度的凝固浴中（常用CaClCaCl2 2 溶液），形成球状固溶液），形成球状固 定化酶。定化酶。 明胶作载体，戊二醛作交联剂制备固定化果胶酯酶明胶作载体，戊二醛作交联剂制备固定化果胶酯酶 15 15明胶溶液明胶溶液100100mImI加入加入1 1mImI酶液。搅拌均匀后，加入酶液。搅拌均匀后，加入5 5浓浓 度的戊二醛度的戊二醛10 10 mImI，充分搅拌，凝固后置充分搅拌，凝固后置44冰箱保存冰箱保存4 4 h h， 取出切成约取出切成约3 3 cmcm2 2见方的小方块，用见方的小方块，用0.50.5浓度的戊二醛溶浓度的戊二醛溶 液浸泡液浸泡161

17、6h h，取出用蒸馏水洗涤数次。取出用蒸馏水洗涤数次。 18 2 2、固定化细胞、固定化细胞 （1 1）概念：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称）概念：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称 为固定化细胞为固定化细胞. .该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定 化活细胞或固定化增殖细胞。化活细胞或固定化增殖细胞。 （2 2）细胞固定化方法：吸附法、包埋法。）细胞固定化方法：吸附法、包埋法。 1 1）吸附法：主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之）吸附法：主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表

18、面与载体之 间范德华作用力、离子键和氢键作用力，使细胞固定在载体上。间范德华作用力、离子键和氢键作用力，使细胞固定在载体上。 2 2）包埋法：在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包）包埋法：在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包 埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优 点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物 的发酵生产。的发酵生产。常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰常用载体：琼脂、海藻

19、酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰 胺。常用凝胶包埋法。胺。常用凝胶包埋法。 19 二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质（一）固定化酶的性质 1 1、酶的活性、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间 位阻。位阻。 2 2、酶的稳定性、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。 表现：表现：1 1）增加酶的耐热性）增加酶的耐热性 2 2）增大了酶对变性剂、抑制剂的抵抗

20、能力）增大了酶对变性剂、抑制剂的抵抗能力 3 3）减轻了蛋白酶的破坏作用）减轻了蛋白酶的破坏作用 4 4）增强贮存的稳定性和操作的稳定性）增强贮存的稳定性和操作的稳定性 原因：原因：a.a.固定化后酶分子与载体多点连接。固定化后酶分子与载体多点连接。 b. b.酶活力的释放是缓慢的。酶活力的释放是缓慢的。 c. c.抑制自降解，提高了酶稳定性。抑制自降解，提高了酶稳定性。 3 3、酶的最适温度、酶的最适温度 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 4 4、酶的最适、酶的最适pH pH 带负电荷载体（带负电荷载体（DEAE-DEAE-纤维素等阴离

21、子聚合物）制备的固定化酶，纤维素等阴离子聚合物）制备的固定化酶， 最适最适pHpH较自然酶偏高；带正电荷载体（较自然酶偏高；带正电荷载体（CMCM - -纤维素等阳离子聚合物）制备的固定纤维素等阳离子聚合物）制备的固定 化酶，最适化酶，最适pHpH较自然酶偏低。较自然酶偏低。 20 采用明胶作载体采用明胶作载体, ,戊二醛作交联剂戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，焦云鹏，20052005） 固定化固定化果胶酯酶的热稳定性果胶酯酶的热稳定性固定化固定化果胶酯酶的果胶酯酶的pHpH稳定性稳定性 21 固定化固定化果胶酯酶作用的最适果胶酯酶作用的最适pHpH值值 采用明

22、胶作载体采用明胶作载体, ,戊二醛作交联剂戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，焦云鹏，20052005） 固定化固定化果胶酯酶作用的最适温度果胶酯酶作用的最适温度 22 5 5、酶的动力学特征、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数KmKm随载体的带电性能变化。随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观KmKm值低于溶液的值低于溶液的KmKm值；值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观KmKm值显著增加。值显著增加。 6 6、酶的作用专一

23、性酶的作用专一性 （二）固定化酶的评价指标（二）固定化酶的评价指标 1 1、酶活力、酶活力 （1 1）酶活定义（）酶活定义（IU)IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化 为产物的酶量定义为为产物的酶量定义为1 1个酶活单位。个酶活单位。1 1Kat=1mol/s = Kat=1mol/s = 60mol/min=6060mol/min=60* *10106 6umol/min =6umol/min =6* *10106 6IUIU （2 2）固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具

24、有的酶活力单位。或： 单位面积（单位面积（cmcm2 2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2 2、蛋白总量、蛋白总量 BCABCA法、考马斯亮蓝法等。法、考马斯亮蓝法等。 23 3 3、 4 4、偶联率及相对活力、偶联率及相对活力 相对酶活力：具有相同酶蛋白（或相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNARNA）量的固定化酶活力与游量的固定化酶活力与游 离酶活力的比值称为相对酶活力离酶活力的比值称为相对酶活力 5 5、半衰期（、半衰期（t t1/2 1/2） ） 衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶 活力下降为最

25、初活力一半所需要的时间（活力下降为最初活力一半所需要的时间（t t1/2 1/2） ） 24 三、固定化酶和固定化细胞的应用三、固定化酶和固定化细胞的应用 （一）基础研究中的作用（一）基础研究中的作用 （二）工农业生产中的应用（二）工农业生产中的应用 1 1、固定化木瓜蛋白酶改善啤酒品质、固定化木瓜蛋白酶改善啤酒品质 2 2、固定化青霉酰化酶合成、固定化青霉酰化酶合成6-6-APAAPA、7-7-ACAACA等等 。通过改变。通过改变pHpH值等条件，可以生值等条件，可以生 成不同的产物。成不同的产物。 3 3、固定化细胞生产固定化细胞生产L-L-苹果酸苹果酸 4 4、其他：葡萄糖异构酶、其他

26、：葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。世界上生产规模最大的一种固定化酶。利用固利用固 定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶。固定化酵母细胞等微生物可用于生定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶。固定化酵母细胞等微生物可用于生 产各种酒类。热点：固定化原生质体的应用。产各种酒类。热点：固定化原生质体的应用。 （三）固定化酶在医药上的应用（三）固定化酶在医药上的应用 1 1、可溶性载体修饰、可溶性载体修饰 用于包埋和修饰药物酶的可溶性载体有：多糖或糖肽、用于包埋和修饰药物酶的可溶性载体有：多糖或糖肽、 聚乙二醇、吡咯烷酮等。聚乙二醇、吡咯烷酮等。 2 2、凝胶包埋、凝胶包埋 3 3、脂质体包埋、脂质体

27、包埋 磷脂双分子层能在水溶液中自发形成超微型中空小泡，具磷脂双分子层能在水溶液中自发形成超微型中空小泡，具 备双重亲和性，具有很好的生物相容性和可生物降解性，无毒，无免疫备双重亲和性，具有很好的生物相容性和可生物降解性，无毒，无免疫 原性。原性。 25 青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素 O H2N R2 R1 NH2 N S O OOH N R1 NH2 N S OO O OH H 1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2

28、= NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe H2O Penicillin G acylase+ Ampicillin (RI = H) Amoxicillin (R1 = OH) 7-ACA as nucleus R2 R1 NH 2 N S N N S R3 R1 O O O OO O H2NNH2 OH R3 H OH + Penicillin G acylase H2O 7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me) Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cef

29、adroxil ( R1 = OH, R3 = Me) 7-ACCA or 7-ADCA as nucleus 26 酶促合成头孢类抗生素酶促合成头孢类抗生素 - Reversible reaction - Hydrolysis of substrate or product by biocatalyst - Difficulty of separation of product from reactants CHCOOCH3 NH2 CHCOOH NH2 CHCONH N S O COOH CH3 NH2 H2N N S O COOH CH3 + H2N N S O COOH CH3 + E

30、sterase Hydrolase Synthetase 27 （四）固定化酶在分析检测中的应用（四）固定化酶在分析检测中的应用 1 1、酶传感器和酶柱检测器、酶传感器和酶柱检测器 酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电 极，进行某些物质的自动分析。极，进行某些物质的自动分析。 酶电极酶电极 特点：快速、方便、灵敏、精确特点：快速、方便、灵敏、精确 范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇 类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等 要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。 28 酶电极酶电极 22 1,5DODH O葡萄糖葡萄糖内酯 29 2 2、酶联免疫测定、酶联免疫测定 基本原理：基本原理： 常用的酶：过氧化氢酶常用的酶：过氧化氢酶 、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶 酶标酶标 与过氧化氢反应与过氧化氢反应 氧电极测定氧电极测定 酶活酶活 抗原（