大肠菌群检测操作规范培训

1、2021/3/131 大肠菌群检测操作规范培训大肠菌群检测操作规范培训 2021/3/132 目录目录 一、细菌介绍一、细菌介绍 二、大肠杆菌生物学特性二、大肠杆菌生物学特性 三、大肠杆菌检测仪器、设备三、大肠杆菌检测仪器、设备 四、检测培养基及试剂四、检测培养基及试剂 五、检测前培养基准备五、检测前培养基准备 六、接种培养六、接种培养 七、七、MPN单位介绍单位介绍 八、检测注意事项八、检测注意事项 2021/3/133 一、细菌介绍一、细菌介绍 细菌是单细胞原核微生物细菌是单细胞原核微生物,个体微小个体微小 （细胞直径约（细胞直径约0.5m, 0.5-5m）,结构结构 简单简单,以二等分裂

2、方式繁殖。在自然界以二等分裂方式繁殖。在自然界 中中,细菌分布最广、数量最多。细菌分布最广、数量最多。 2021/3/134 1、细菌的形态 细菌个体微小、形态各异细菌个体微小、形态各异 球菌球菌 杆菌杆菌 弧菌与弯曲菌弧菌与弯曲菌 螺旋菌及螺旋体螺旋菌及螺旋体 不规则形不规则形 弧菌弧菌 2021/3/135 2、细菌的结构 细菌的基本结构包括细菌的基本结构包括:细胞壁、细胞壁、 细胞膜、间细胞膜、间 体、细胞浆、核糖体、细胞质。体、细胞浆、核糖体、细胞质。 细菌的附属结构包括细菌的附属结构包括:质粒、荚膜、鞭毛、质粒、荚膜、鞭毛、 菌毛和芽胞。菌毛和芽胞。 2021/3/136 3、细菌的

3、繁殖 细菌最普遍、最主要的繁殖方式细菌最普遍、最主要的繁殖方式:二分分裂繁二分分裂繁 殖。在分裂前先延长菌体殖。在分裂前先延长菌体,染色体复制为二染色体复制为二,然然 后垂直于长轴分裂后垂直于长轴分裂,细胞赤道附近的细胞质膜细胞赤道附近的细胞质膜 凹陷生长凹陷生长,直至形成横隔膜直至形成横隔膜,同时形成横隔壁同时形成横隔壁,这这 样便产生两个子细胞样便产生两个子细胞。 2021/3/137 4、细菌的菌落 单个或少数细菌细胞生长繁殖后单个或少数细菌细胞生长繁殖后,会形成以会形成以 母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形 态构造的子细胞集团菌落。态构造的子细胞集

4、团菌落。 2021/3/138 细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较 透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面 或边缘与中央部位颜色一致等。或边缘与中央部位颜色一致等。 2021/3/139 细菌的菌落图细菌的菌落图 2021/3/1310 二、大肠杆菌生物学特性 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、 克雷伯氏菌等克雷伯氏菌等,均属于

5、肠杆菌。均属于肠杆菌。 2021/3/1311 大肠菌群以大肠埃希氏菌为主大肠菌群以大肠埃希氏菌为主,是革兰氏阴是革兰氏阴 性、两端钝圆的杆菌性、两端钝圆的杆菌,无芽孢无芽孢,以周生鞭毛运以周生鞭毛运 动或不运动。动或不运动。 最适生长温度为最适生长温度为37,在在42-44条件下仍条件下仍 能生长能生长,生长温度范围为生长温度范围为15-46。 2021/3/1312 1、大肠杆菌平板菌落照片 2021/3/1313 2、大肠杆菌革兰氏染色照片 2021/3/1314 3、大肠杆菌微菌落照片 2021/3/1315 4、大肠杆菌透射电镜照片 2021/3/1316 5、大肠杆菌扫描电镜照片

6、2021/3/1317 6、大肠杆菌分裂照片 2021/3/1318 三、检测仪器、设备 冰箱冰箱:04 恒温培养箱恒温培养箱:361 恒温水浴锅恒温水浴锅:461 微生物显微镜微生物显微镜 2021/3/1319 架盘药物天平架盘药物天平:0g500g,精确至精确至0.5g 三角瓶三角瓶:500ml 灭菌吸管灭菌吸管:1ml、10ml 灭菌平皿灭菌平皿:直径直径90mm 试管试管:18180mm 2021/3/1320 四、检测培养基及试剂 乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管 伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂 乳糖发酵管乳糖发酵管 革兰氏染色液革兰氏染色液 生理盐水生理盐水 2021/3/1321 乳糖胆

7、盐发酵管乳糖胆盐发酵管:用于大肠菌群的测定。用于大肠菌群的测定。35g乳乳 糖胆盐于糖胆盐于1升蒸馏水中升蒸馏水中,溶解溶解,分装于发酵试管中分装于发酵试管中, 放入小倒管放入小倒管,11515分钟高压灭菌。双料乳糖分钟高压灭菌。双料乳糖 胆盐发酵管除蒸馏水外胆盐发酵管除蒸馏水外,其它成分加倍。其它成分加倍。 2021/3/1322 乳糖发酵管乳糖发酵管:大肠菌群证实试验用。大肠菌群证实试验用。 30g乳乳 糖于糖于1升蒸馏水中升蒸馏水中,溶解溶解,分装于发酵试管中分装于发酵试管中, 放入小倒管放入小倒管,11515分钟高压灭菌。分钟高压灭菌。 2021/3/1323 伊红美兰琼脂伊红美兰琼脂

8、:用于大肠菌群的固体平板检用于大肠菌群的固体平板检 测。测。 37.5g于于1升蒸馏水中升蒸馏水中,摇匀摇匀,加热煮加热煮 沸沸,12115分钟高压灭菌。分钟高压灭菌。 2021/3/1324 五、检测前培养基准备 检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培 养基小导管内是否有气体。养基小导管内是否有气体。 按产品品种将培养基分别放在试管架内按产品品种将培养基分别放在试管架内,同同 时将时将9ml 0.85%灭菌盐水管也放入相应的试灭菌盐水管也放入相应的试 管架内。管架内。 2021/3/1325 六、接种培养 （一）酸牛奶系列产品（一）酸牛奶系列产品 酸牛奶系列

9、产品接种单料乳糖胆盐发酵培养酸牛奶系列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养 基基9支管支管,分别接种样品量为分别接种样品量为1ml (原浓度原浓度)3 支支,0.1ml (10-1浓度浓度)3支支,0.01ml (10-2浓度浓度)3支支。 2021/3/1326 1、 1ml接种培养 在无菌条件下在无菌条件下,用用1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1ml样品样品 试液于含有试液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中灭菌盐水试管中,振荡振荡 摇匀制成摇匀制成1:10的稀释液的稀释液;同时分别吸取同时分别吸取1ml 样品试液于样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内支单料乳糖胆盐发酵管内,并轻并轻 微振荡摇匀微振荡

10、摇匀,放入原位置。放入原位置。 2021/3/1327 2、 0.1ml接种培养 另换另换1根根1ml灭菌移液管吸取灭菌移液管吸取1:10的稀释液的稀释液 1ml于含有于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中灭菌盐水试管中,振荡振荡 摇匀制成摇匀制成1:100的稀释液的稀释液;同时分别吸取同时分别吸取1ml 1:10稀释液于稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内支单料乳糖胆盐发酵管内,并并 轻微振荡摇匀轻微振荡摇匀,放入原位置。放入原位置。 2021/3/1328 3、 0.01ml接种培养 另换另换1根根1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 1:100稀释液于稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管

11、内支单料乳糖胆盐发酵管内, 并轻微振荡摇匀并轻微振荡摇匀,放入原位置。放入原位置。 2021/3/1329 4、接种过程操作录像检测接种过程操作录像检测单料大肠检单料大肠检 测测.MPG 2021/3/1330 5、接种后培养 将接种完的试管连同试管架一起置于将接种完的试管连同试管架一起置于 361的培养箱内培养的培养箱内培养242h,观察乳糖观察乳糖 胆盐发酵管的变化情况。胆盐发酵管的变化情况。 2021/3/1331 6、结果查询并记录 若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气,则报 告大肠菌群阴性。 若有产酸产气,则要做证实试验。 2021/3/1332 （二）活性乳酸菌饮料系列产品 活性乳酸菌

12、饮料系列产品接种双料乳糖胆活性乳酸菌饮料系列产品接种双料乳糖胆 盐发酵培养基盐发酵培养基3支管支管,单料乳糖胆盐发酵培养单料乳糖胆盐发酵培养 基基6支支,分别接种样品量为分别接种样品量为10ml 3支支,1ml 3 支支,0.1ml 3支。支。 2021/3/1333 1、 10ml接种培养 在无菌条件下在无菌条件下,用用1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1ml样品试样品试 液于含有液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中灭菌盐水试管中,振荡摇匀振荡摇匀 制成制成1:10的稀释液的稀释液;同时用同时用10ml灭菌吸管分别灭菌吸管分别 吸取吸取10ml样品试液于样品试液于3支双料乳糖胆盐发酵管支双料乳

13、糖胆盐发酵管 内内,并轻微振荡摇匀并轻微振荡摇匀,放入原位置。放入原位置。 2021/3/1334 2、 1ml接种培养 另用另用1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 样品试液样品试液 于于3支单料乳糖胆盐发酵管内支单料乳糖胆盐发酵管内,并轻微振荡摇并轻微振荡摇 匀匀,放入原位置。放入原位置。 2021/3/1335 3、 0.1ml接种培养 另换另换1根根1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 1:10 稀释液于稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内支单料乳糖胆盐发酵管内,并轻微并轻微 振荡摇匀振荡摇匀,放入原位置。放入原位置。 2021/3/1336 4、接种过程操作录像检

14、测、接种过程操作录像检测双料大肠检双料大肠检 测测.MPG 2021/3/1337 5、接种后培养 将接种完的试管连同试管架一起置于将接种完的试管连同试管架一起置于 361的培养箱内培养的培养箱内培养242h,观察乳糖观察乳糖 胆盐发酵管的变化情况。胆盐发酵管的变化情况。 2021/3/1338 6、结果查询并记录 若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气,则报则报 告大肠菌群阴性告大肠菌群阴性。 若有产酸产气若有产酸产气,则要做证实试验。则要做证实试验。 2021/3/1339 （三）证实试验 1、伊红美蓝琼脂平板分离 将产酸产气乳糖胆盐发酵管内的培养物分将产酸产气乳

15、糖胆盐发酵管内的培养物分 别接种于伊红美兰琼脂平板别接种于伊红美兰琼脂平板(划线分离划线分离),置置 于于361的培养箱内培养的培养箱内培养242h。 2021/3/1340 接种和分离工具 1接种针接种针 2.接种环接种环 3.接种钩接种钩 4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.接种圈接种圈 7.接种锄接种锄 8.小解剖刀小解剖刀 2021/3/1341 平板分离画线法 1.斜线法斜线法 2.曲线法曲线法 3.方格法方格法 4.放射法放射法 5.四格四格 法法 2021/3/1342 将伊红美蓝琼脂平板从培养箱取出后,观察 菌落形态,并做革兰氏染色和乳糖复发酵试 验。 革兰氏染色:见革兰氏染色及镜检

16、操作规 范。 2021/3/1343 （四）乳糖发酵试验 挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖 发酵培养基,置于361的培养箱内培养 242h,观察产气情况。 2021/3/1344 凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管产 酸产气的菌落即可报告大肠菌群阳性。 2021/3/1345 根据证实为大肠菌群的阳性管数根据证实为大肠菌群的阳性管数,查查MPN检检 索表索表,查找每查找每100ml样品内的大肠菌群的样品内的大肠菌群的 MPN值。值。 将检测结果填入将检测结果填入微生物检测报告单微生物检测报告单,并并 及时传递给相关部门。及时传递给相关部门。 2021/3/1346 七、MPN单位介绍 MP

17、N=Most Probable Number ,最大可能最大可能 数数 ,是一种利用统计学检测微生物的方法。是一种利用统计学检测微生物的方法。 食品大肠菌群是以每克或食品大肠菌群是以每克或100ML中大肠菌中大肠菌 群的最近似值群的最近似值,是用是用MPN来表示。来表示。 2021/3/1347 采用采用9管法管法,对样品选三个稀释度对样品选三个稀释度,每个稀释每个稀释 度接种三管相应的培养基进行培养度接种三管相应的培养基进行培养,然后根然后根 据情况做出判断阳性和阴性据情况做出判断阳性和阴性,再根据不同稀再根据不同稀 释度的阳性管数查表即可得到被测样品相释度的阳性管数查表即可得到被测样品相 应指标的应指标的MPN值。值。 2021/3/1348 八、注意事项 乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡,需轻振试需轻振试 管管,若有气泡上冒若有气泡上冒,也算产气。也算产气。 在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属 光泽光泽,则为典型菌落则为典型菌