生化分离工程：复习---生化分离工程

1、1 2 生化分离工程一般工艺过程生化分离工程一般工艺过程 预处理预处理 细胞分离细胞分离细胞破壁细胞破壁 碎片分离碎片分离提取提取 精制精制 成品制备成品制备 预分离预分离 - 提取提取 - 精制精制 - 成品制备成品制备 加热加热 调节调节pH 絮凝絮凝 过滤过滤 离心离心 机械法机械法 物理法物理法 化学法化学法 过滤过滤 离心离心 沉淀沉淀 萃取萃取 泡沫分离泡沫分离 吸附吸附 结晶结晶 离子交换离子交换 色谱色谱 膜分离膜分离 电泳电泳 浓缩浓缩 结晶结晶 干燥干燥 3 分离菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉分离菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉 淀物）。淀物）

2、。 除去部分可溶性杂质。除去部分可溶性杂质。 改变滤液的性质（降低黏度等），利于后续操作。改变滤液的性质（降低黏度等），利于后续操作。 预处理的目的和预处理的目的和意义意义 目的目的 4 1、改变液体物理性质，促进固液分离。、改变液体物理性质，促进固液分离。 n某些细菌及放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过某些细菌及放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过 滤，由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造滤，由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质造 成滤液浑浊，滤速极慢。成滤液浑浊，滤速极慢。 n预处理中采用预处理中采用絮凝或凝聚絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮报中固体的方法，设法增

3、大悬浮报中固体 粒子的大小，提高其沉降速度，或采用粒子的大小，提高其沉降速度，或采用稀释、加热稀释、加热等方法等方法 降低粘度，以利于过滤。降低粘度，以利于过滤。 2、使目的产物进入一相，便于后续提取、使目的产物进入一相，便于后续提取 意义： 5 高价无机离子危害：高价无机离子危害： 在采用离子交换法提炼时，影响树脂的交换容量。在采用离子交换法提炼时，影响树脂的交换容量。 杂蛋白质的危害：杂蛋白质的危害： a)a) 离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时，会降低吸附能力，离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时，会降低吸附能力， b)b) 萃取时，易产生乳化。萃取时，易产生乳化。 c)c) 过滤或膜过滤

4、时，使滤速下降，膜受到污染。过滤或膜过滤时，使滤速下降，膜受到污染。 3、尽可能去除杂质、尽可能去除杂质 发酵液杂质很多，其中影响最大的是高价无机离发酵液杂质很多，其中影响最大的是高价无机离 子和杂蛋白，预处理时，应尽量除去。子和杂蛋白，预处理时，应尽量除去。 6 n加热加热 n调调pHpH值值 n凝聚及絮凝凝聚及絮凝 n加水稀释法加水稀释法 n冷冻冷冻- -解冻解冻 n降低粘度降低粘度 n增加粒度增加粒度 便于分离便于分离 发酵液预处理发酵液预处理方法方法 7 n最简单和最廉价的处理方法。最简单和最廉价的处理方法。 n黏度黏度 、促凝聚、促凝聚 、破坏凝胶结构、增加空隙率、破坏凝胶结构、增加

5、空隙率、 去蛋白去蛋白 n增加料液的操作特性，可以同时对其灭菌。增加料液的操作特性，可以同时对其灭菌。 n发酵液温度从发酵液温度从2020升温至升温至5050，粘度降低，粘度降低45%45% 加热加热 |只适合于对热稳定性的产物。只适合于对热稳定性的产物。 8 0 0 200 400 600 612 18 pH 4.6 pH 4.2 pH 3.8 pH 2.8 Filtrate Volume/cm 3 Time/min pH值对过滤量的影响 调调pH值：方法简单有效、成本低廉；值：方法简单有效、成本低廉； 9 n凝聚凝聚指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥指在电解质作用下，由于胶粒之间双

6、电层电排斥 作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象； n絮凝絮凝指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用， 使胶粒形成较大絮凝团的过程。使胶粒形成较大絮凝团的过程。 采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的 分散状态，聚结成较大颗粒，提高过滤速率。有效地除去杂蛋白和固分散状态，聚结成较大颗粒，提高过滤速率。有效地除去杂蛋白和固 体杂质，提高滤液质量。体杂质，提高滤液质量。 凝聚和絮凝凝聚和絮凝 10 凝聚剂种类凝聚剂种类：

7、 A、无机盐类，如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、无机盐类，如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁 B、无机碱，如、无机碱，如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等；等； C、聚合无机盐，如聚合铝、聚合铁。、聚合无机盐，如聚合铝、聚合铁。 机理机理：A、破坏双电层，、破坏双电层，B、胶体吸附、胶体吸附 C、氢键结合、氢键结合 凝聚作用凝聚作用 发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结 构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。 11 n絮凝剂絮凝剂: :能溶于水的高分子聚合物能溶于水的

8、高分子聚合物，长链线状，长链线状， 分子量数万至千万以上，含有活性功能团（阴离分子量数万至千万以上，含有活性功能团（阴离 子型、阳离子型、非离子型）子型、阳离子型、非离子型）, ,通过静电引力、通过静电引力、 范德华引力或氢键的作用，强烈吸附。范德华引力或氢键的作用，强烈吸附。 n机理机理：絮凝剂中和电荷、架桥和网络作用：絮凝剂中和电荷、架桥和网络作用 12 13 高价无机离子的去除高价无机离子的去除 Ca 2+ -草酸成盐，生长所必须元素草酸成盐，生长所必须元素 去除剂：草酸或钠盐去除剂：草酸或钠盐 草酸钙促进蛋白质凝固，提高滤液过滤速度和滤液草酸钙促进蛋白质凝固，提高滤液过滤速度和滤液 质

9、量质量 链霉素发酵液预处理方法：草酸量链霉素发酵液预处理方法：草酸量8-12kg/m3 搅拌搅拌 30-60min，调，调pH2.8-3.5以除去金属离子。以除去金属离子。 14 2、除去镁离子：、除去镁离子： 加入加入三聚磷酸钠三聚磷酸钠，它和镁离子形成可溶性络，它和镁离子形成可溶性络 合物：合物： 用用磷酸盐磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓 度。此法可用于环丝氨酸的提炼。度。此法可用于环丝氨酸的提炼。 15 3、除去铁离子：、除去铁离子： 可加入可加入黄血盐黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。，使形成普鲁士蓝沉淀。 16 固液分离固液分离 17 溶剂和

10、小于膜孔的溶质透过膜，大于膜孔的颗粒截溶剂和小于膜孔的溶质透过膜，大于膜孔的颗粒截 留堆积在膜面上。留堆积在膜面上。 膜面上堆积的颗粒随着时间的增加而增加，过滤阻膜面上堆积的颗粒随着时间的增加而增加，过滤阻 力增大，膜渗透速率下降。力增大，膜渗透速率下降。 要周期性停下来清洗膜表面的污染层，或者更换膜。要周期性停下来清洗膜表面的污染层，或者更换膜。 操作简单，适于小规模场合。操作简单，适于小规模场合。 过滤技术过滤技术 常规过滤常规过滤 18 改善过滤性能的方法改善过滤性能的方法 对于难过滤的发酵液，必须设法改善过滤性能、降低滤对于难过滤的发酵液，必须设法改善过滤性能、降低滤 饼的比阻值，以提

11、高过滤速度。饼的比阻值，以提高过滤速度。 改善过滤性能的方法：改善过滤性能的方法： 1、预处理发酵液。等电点，蛋白质变性、吸附以及凝聚、预处理发酵液。等电点，蛋白质变性、吸附以及凝聚 和絮凝等方法和絮凝等方法。 2、加入助滤剂，直接在发酵液中形成填充一凝固剂。、加入助滤剂，直接在发酵液中形成填充一凝固剂。 3、酶解作用、酶解作用 19 3离心技术离心技术 应用：应用： A A、难过滤的发酵液：不能过滤的悬浮液，以及忌用助滤剂、或助滤、难过滤的发酵液：不能过滤的悬浮液，以及忌用助滤剂、或助滤 剂无效的悬浮液；剂无效的悬浮液； B B、其他难分离的固液分离；、其他难分离的固液分离； C C、互不相

12、溶液、互不相溶液液分离，如液液萃取；液分离，如液液萃取； D D、不同密度固体或乳浊液的密度梯度分离，如超离心分离、不同密度固体或乳浊液的密度梯度分离，如超离心分离 缺点：缺点： A A、分离得到的不是滤饼一样的半干物，而是浆状物；、分离得到的不是滤饼一样的半干物，而是浆状物； B B、处理量小；、处理量小； C C、设备复杂，价格贵，分离成本高。、设备复杂，价格贵，分离成本高。 操作形式：操作形式： A A、离心沉降；、离心沉降；B B、离心过滤；、离心过滤；C C、密度梯度、密度梯度( (超离心超离心) )。 20 细胞破碎技术细胞破碎技术 机械破碎机械破碎 捣碎法捣碎法 研磨法研磨法 匀

13、浆法匀浆法 超声法超声法 物理破碎物理破碎 温度差破碎法温度差破碎法 压力差破碎法压力差破碎法 化学破碎化学破碎 有机溶剂：有机溶剂： 表面活性剂：表面活性剂： 酸碱酸碱 酶促破碎酶促破碎 自溶法自溶法 外加酶制剂法外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切力，通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎。使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用，使组通过各种物理因素的作用，使组 织、细胞的外层结构破坏，而使织、细胞的外层结构破坏，而使 细胞破碎。细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞膜的通过各种化学试剂对细胞膜的 作用，而使细胞破碎作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外加酶制通过细胞本身的酶系或

14、外加酶制 剂的催化作用，使细胞外层结构剂的催化作用，使细胞外层结构 受到破坏，而达到细胞破碎受到破坏，而达到细胞破碎 21 微生微生 物物 革兰氏革兰氏 阳性细菌阳性细菌 革兰氏革兰氏 阴性细菌阴性细菌 酵母菌酵母菌霉菌霉菌 壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm 层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层 主要主要 组成组成 肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%) 多糖多糖 胞壁酸胞壁酸 蛋白质蛋白质 脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%) 肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)

15、脂蛋白脂蛋白 脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%) 磷脂磷脂 蛋白质蛋白质 葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%) 甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%) 蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%) 脂类脂类(8.5-(8.5- 13.5%)13.5%) 多聚糖多聚糖 (80-90%)(80-90%) 脂类脂类 蛋白质蛋白质 微生微生 物物 革兰氏革兰氏 阳性细菌阳性细菌 革兰氏革兰氏 阴性细菌阴性细菌 酵母菌酵母菌真菌真菌 壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm 层次层次单层单层多

16、层多层多层多层多层多层 主要主要 组成组成 肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%) 多糖多糖 胞壁酸胞壁酸 蛋白质蛋白质 脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%) 肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%) 脂蛋白脂蛋白 脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%) 磷脂磷脂 蛋白质蛋白质 葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%) 甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%) 蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%) 脂类脂类(8.5-(8.5- 13.5%)13.5%) 多聚糖多聚糖 (80-90%)(80-90%) 脂类脂类 蛋白质蛋白质 细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构 22 n细胞浓度细

17、胞浓度 40%左右左右 n珠粒大小珠粒大小 一般在一般在0.4mm以下，材质要求：无以下，材质要求：无 铅铅 n最适合真菌和藻类最适合真菌和藻类 nYeast优于细菌优于细菌 n珠磨法珠磨法 23 高压匀浆法高压匀浆法大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法 高压匀浆法适用的范围：高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。 不宜使用高压匀浆法：不宜使用高压匀浆法： 易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因

18、工程菌（包含体坚硬，易损伤匀浆阀）含有包含体的基因工程菌（包含体坚硬，易损伤匀浆阀） 24 A、在大规模、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和破碎中，高压匀浆机和 珠磨机用得最多珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌 菌丝和藻类也合适菌丝和藻类也合适. 特点总结特点总结 25 蛋白质的溶解性和稳定性蛋白质的溶解性和稳定性与蛋白质的表面性质相关与蛋白质的表面性质相关 沉淀沉淀 26 蛋白质周围的水化层蛋白质周围的水化层， 使蛋白质形成稳定的胶体溶液。使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 蛋

19、白质蛋白质分子间静电排斥作用。分子间静电排斥作用。（存在（存在 双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电 的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电 离。离。 。 27 盐溶：盐溶：在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加。 盐溶的作用机理：盐溶的作用机理：蛋白质表面电荷吸附某种盐离子后，带电表层 使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作 用却加强，因而使溶解度提高. 盐析法盐析法 28 n盐析盐析：在：在 29 l有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核

20、酸、多糖和小 分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉 淀方法之一。淀方法之一。 l优点在于：优点在于：1 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只 在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2 2）沉淀不用）沉淀不用 脱盐，过滤较为容易；脱盐，过滤较为容易； l缺点是缺点是1 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失）对具有生物活性的大分子容易引起变性失 活，活，2 2）操作要求在低温下进行。）操作要求在低温下进行。3 3）成本高）成本高 l总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析总体

21、来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析 法普遍。法普遍。 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 30 *A A 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数（介电常数（介电常数D D有机有机 D D水）水） ， *B B 破坏水化膜：破坏水化膜： *C C 相反力：相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形 成疏水层成疏水层 沉淀机理沉淀机理 31 等电点沉淀法等电点沉淀法 机理：机理： 不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进 行分离。行分离。 生产胰岛素时，在粗提液中先调生产胰岛素时，在粗提液中先调PH8.0去除碱

22、性蛋白质，去除碱性蛋白质， 再调再调PH3.0去除酸性蛋白质。去除酸性蛋白质。 32 单级萃取最多为一次平衡，故分离程度不高，单级萃取最多为一次平衡，故分离程度不高， 适用于溶质在萃取剂中的溶解度很大或溶质萃取率要求不适用于溶质在萃取剂中的溶解度很大或溶质萃取率要求不 高的场合。高的场合。 萃取相萃取相 Extract 萃余相萃余相 Raffinate 料液料液A+B Feed 萃取剂萃取剂 Solvent 混合澄清槽混合澄清槽 Mixer-settler 33 单级萃取单级萃取 萃取器萃取器分离器分离器回收器回收器 F S R P（产物）（产物） 使用一个混合器和一个分离器的萃取操作：使用一

23、个混合器和一个分离器的萃取操作： 34 n萃取操作理论收得率的计算须符合以下两个假定：萃取操作理论收得率的计算须符合以下两个假定： 萃取相和萃余相很快达到平衡萃取相和萃余相很快达到平衡 两相完全不互溶，在分离器中能完全分离。两相完全不互溶，在分离器中能完全分离。 nk为分配系数为分配系数 nE为为萃取因子，萃取因子，即萃取平衡后，溶质在萃取相与萃即萃取平衡后，溶质在萃取相与萃 余相中质量的比值余相中质量的比值 H kL E kyx/ 35 计算 例：利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素例：利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D(Actinomycin D), pH3.5时分配系数时分配系数k =5

24、7。令。令H = 450 l/h,单级萃取剂流量为单级萃取剂流量为39 l/h。计算单级萃取的萃取率。计算单级萃取的萃取率。 解解: 单级萃取的萃取因子：单级萃取的萃取因子：E = 57*39/450 = 4.94 单级萃取率：单级萃取率： = 4.94/（1+4.94） = 0.832 H kL E 36 反胶束萃取反胶束萃取 反胶束萃取：反胶束萃取：利用反胶束将目标产物从混合液利用反胶束将目标产物从混合液 中萃取出来的纯化技术。中萃取出来的纯化技术。 37 反胶束萃取 n反胶束是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性反胶束是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性 基团自发地向内聚集而成的，

25、内含微小水滴的，空间基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间 尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排 列而成的，并具热力学稳定的有序构造。列而成的，并具热力学稳定的有序构造。 38 特点特点 成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很 高，高，具有选择性。具有选择性。 可以解决蛋白质可以解决蛋白质( (胞内酶胞内酶) )在非细胞环境中迅速失活在非细胞环境中迅速失活 的问题，的问题， 构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力， 可用于直接从整

26、细胞中提取蛋白质和酶。可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。 39 临界胶束浓度临界胶束浓度 (Critical Micelle Concentration CMC) 临界胶束浓度临界胶束浓度, ,是胶束形成时所需表面活性剂的是胶束形成时所需表面活性剂的 最低浓度，用最低浓度，用CMCCMC来表示来表示; ; 与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力 等因素有关。等因素有关。 nCMC的数值可通过测定各种物理性质的突变的数值可通过测定各种物理性质的突变(如表面如表面 张力、渗透压等张力、渗透压等)来确定。来确定。 40 专用表面活性剂专用表面活性剂 反胶束

27、是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形 成的纳米尺度的聚集体，表面活性剂是反胶束溶液形成的纳米尺度的聚集体，表面活性剂是反胶束溶液形 成的关键。成的关键。 表面活性剂是两性分子，可分为阴离子表面活性剂、表面活性剂是两性分子，可分为阴离子表面活性剂、 阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，都形成反阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，都形成反 胶束。胶束。 41 阴离子阴离子表面活性剂表面活性剂 在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子 表面活性剂表面活性剂AOT(AerosolOTAOT(Aer

28、osolOT) )，其化学名为丁二酸，其化学名为丁二酸2 2 乙基己基酯磺酸钠，结构式见图乙基己基酯磺酸钠，结构式见图 42 n有机溶剂通常采用异辛烷。有机溶剂通常采用异辛烷。 n表面活性剂表面活性剂AOT能迅速溶于有机溶剂，也能溶于水而能迅速溶于有机溶剂，也能溶于水而 形成液晶态（非球状）胶团。形成液晶态（非球状）胶团。 n所形成的胶团的含水率高（所形成的胶团的含水率高（ 0 0为为50506060），比季铵盐），比季铵盐 高一个数量级以上；高一个数量级以上； AOT作为反向微胶团的表面活性剂的特点：作为反向微胶团的表面活性剂的特点： 43 容易获得，容易获得， 具有双链，具有双链， 极性基

29、团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂， 形成的反胶束较大，半径为形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白，有利于大分子蛋白 质进入。质进入。 44 n蛋白质为两性分子，各种蛋白质有确定的等电点蛋白质为两性分子，各种蛋白质有确定的等电点(pI)， 以以AOT为例，当为例，当pHpI时，蛋白质分子和表面活性剂内表面都荷负时，蛋白质分子和表面活性剂内表面都荷负 电，相互排斥，蛋白质难溶于胶团中。电，相互排斥，蛋白质难溶于胶团中。 npH过低时，蛋白质会变质，溶解度也降低。过低时，蛋白质会变质，溶解度也降低。 45 超临界流体萃取超临界流体萃

30、取 n流体：流体：液体和气体的总称液体和气体的总称, , 两者都富有流动性两者都富有流动性, ,又有相似的运动规律又有相似的运动规律, , 故合称流体。故合称流体。 n临界状态：临界状态：物质的气、液两态平衡共存的边缘状态物质的气、液两态平衡共存的边缘状态, , 该状态下该状态下, ,液体液体 和它的饱和蒸汽密度相同和它的饱和蒸汽密度相同, ,其界面消失其界面消失, ,这状态只能在一定温度和压强这状态只能在一定温度和压强 下实现。下实现。 n超临界流体超临界流体：指物质处于其临界温度和临界压强以上而形成的一种特：指物质处于其临界温度和临界压强以上而形成的一种特 殊状态的流体。殊状态的流体。 4

31、6 n任何一种气体均有一个任何一种气体均有一个“临界点临界点”，气体在临界点时所对应的温，气体在临界点时所对应的温 度和压力称为度和压力称为临界温度和临界压力临界温度和临界压力。 n当气体的温度和压力高于其临界温度和临界压力时，则称该气体当气体的温度和压力高于其临界温度和临界压力时，则称该气体 为为超临界流体超临界流体。 n该流体特征该流体特征 q密度接近于液体的密度密度接近于液体的密度 q粘度和扩散系数与普通气体相近粘度和扩散系数与普通气体相近 q具有极强的溶解能力具有极强的溶解能力 47 1 1）原理：）原理： 以选择性透膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、以选择性透膜为分

32、离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、 压力差或电压差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分压力差或电压差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分 离提纯的目的。离提纯的目的。 通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。 选择性透膜选择性透膜 膜上游 透膜 膜下游 膜和膜分离的基本理论 48 膜组件 n由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这 些部件的容器构成的一个单元称为膜组件或些部件的容器构成的一个单元称为膜组件或 膜装置。膜装置。 49 50 凝胶层析凝胶层析 （1 1）凝胶的种类和性质）凝胶

33、的种类和性质 A A 交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（SephadexSephadex) ) Sephadex Sephadex G G 系列系列 G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍。倍。 G G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 51 2 2）琼脂糖凝胶（）琼脂糖凝胶（SepharoseSepharose；Bio-Gel)Bio-Gel) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂 糖密度越大，网状结构越密集。糖密度越大，网状结构越密集。 3 3） 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 一种人工合成

34、的凝胶，以丙烯酰胺为单位，一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙 度越小。商品名为生物胶度越小。商品名为生物胶PP（Bio-Gel P).Bio-Gel P). 4 4） 聚丙乙烯凝胶（聚丙乙烯凝胶（StyrogelStyrogel) ) 大网孔结构。大网孔结构。 52 表表 葡聚糖凝葡聚糖凝胶胶(Sephadex(Sephadex ) )的物理特性的物理特性 品品 名名得水值得水值 床体积床体积 /mL.g-1 最适分离范最适分离范 围围 Sephadex G-101.00.12-3700 Sephadex

35、 G-151.50.22.5-3.51500 Sephadex G-252.50.24-61000-5000 Sephadex G-505.00.39-111500-30000 Sephadex G-757.50.512-153000-70000 Sephdex G-10010l.015-204000-150000 Sephadex G-150151.520-305000-400000 Sephadex G-200202.030-405000-800000 53 床体积（床体积（bed volumebed volume） n即即1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sep

36、hadex G50 的床体积为的床体积为911 cm3/g干胶。干胶。 空隙体积（空隙体积（void volumevoid volume） n指色谱柱中凝胶之间空隙的体积，即指色谱柱中凝胶之间空隙的体积，即V0值。空隙体值。空隙体 积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一 般使用平均相对分子质量为般使用平均相对分子质量为2000 kD的水溶性蓝色的水溶性蓝色 葡聚糖（葡聚糖（blue dextran）。大分子的洗脱体积）。大分子的洗脱体积(Ve)就就 是该凝胶柱的空体积是该凝胶柱的空体积(V0)。 54 根据分离范围选择合适型号的凝胶。例如蛋白脱

37、盐常根据分离范围选择合适型号的凝胶。例如蛋白脱盐常 采取分离范围较小的采取分离范围较小的SephadexSephadex G-10 G-10或或G-15G-15。 凝胶的颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速凝胶的颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速 慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重；颗粒大，慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重；颗粒大， 流速快，分辨率低。流速快，分辨率低。 检查柱装得是否均匀：用凝胶完全排阻的蓝色葡聚糖检查柱装得是否均匀：用凝胶完全排阻的蓝色葡聚糖 (blue dextran)2000作样品，层析时，有色区带移动整作样品，层析时，有色区带移动整 齐。齐。 蓝色

38、葡聚糖蓝色葡聚糖(blue dextran)2000是平均分子质量为是平均分子质量为 2106，与蓝色染料偶联，在，与蓝色染料偶联，在265nm及及630nm处都有处都有 吸收峰。吸收峰。 凝胶的种类及应用凝胶的种类及应用 55 56 吸附色谱吸附色谱 原理：依据吸附剂对混合物中各成分吸附性能的不原理：依据吸附剂对混合物中各成分吸附性能的不 同，使各成分得到分离。同，使各成分得到分离。 57 极性及其强弱判断极性及其强弱判断 (1).化合物的极性：按下列官能团的顺序增强化合物的极性：按下列官能团的顺序增强 -CH2-CH2-，-CH=CH-，-OCH3，-COOR，C=O， -CHO，-NH2

39、，-OH，-COOH 化合物的极性：由分子中所含官能团的化合物的极性：由分子中所含官能团的 种类、数量及排列方式等综合因素决定。种类、数量及排列方式等综合因素决定。 极性增强方向极性增强方向 58 离子交换树脂的结构离子交换树脂的结构 带有活性基团的网状高分子聚合物 骨架 活性基团活性基团 酚醛树脂 聚乙烯树脂 OH + CH2O CH=CH2 + CH=CH2 CH=CH2 交联剂 酸性基团 碱性基团 SO3H COOH N+R3 NR2 特殊基团 离子交换色谱离子交换色谱 59 交联剂：交联剂：由于二乙烯苯的加入，致使长链的聚苯乙烯构成了由于二乙烯苯的加入，致使长链的聚苯乙烯构成了立体立体

40、 网状结构。网状结构。因此，把二乙烯苯称为因此，把二乙烯苯称为交联剂。交联剂。 交联度：交联度：交联剂在树脂单体总量中所占质量分数称为交联剂在树脂单体总量中所占质量分数称为交联度。交联度。一一 般般交联度为交联度为414，常见为常见为8。交联度对以下因素产生影响：。交联度对以下因素产生影响： （1）网状结构的紧密度）网状结构的紧密度 （2）孔径大小）孔径大小 （3）交换速度）交换速度 （4）选择性）选择性 60 4. 树脂的命名树脂的命名 根据离子交换树脂官能团的性质，分为强根据离子交换树脂官能团的性质，分为强 酸、弱酸、强碱、弱酸、弱酸、强碱、弱 碱、螯合、两性及氧化还原等碱、螯合、两性及氧

41、化还原等 7类。规定如下：类。规定如下： 离子交换树脂的全名由分类名称、骨架离子交换树脂的全名由分类名称、骨架(或基或基 团团)名称、基本名名称、基本名 称称(离子交换树脂离子交换树脂)排列组成。排列组成。 氧化还原树脂与离子交换树脂的特性不氧化还原树脂与离子交换树脂的特性不 同。故在命名的排列上同。故在命名的排列上 也有不同，其命名由基本名称、骨架名称、分类名称和树脂两也有不同，其命名由基本名称、骨架名称、分类名称和树脂两 字排列组成。字排列组成。 凡属酸性的应在基本名称前加一凡属酸性的应在基本名称前加一“阳阳”字；字； 凡属碱性的，在基本名称前加一凡属碱性的，在基本名称前加一“阴阴”字。字

42、。 61 命名方法命名方法 离子交换树脂的型号由离子交换树脂的型号由3位阿拉伯数字组成。位阿拉伯数字组成。 第第1位数字代表产品的分类，位数字代表产品的分类， 第第2位数字代表骨架结构的差异，位数字代表骨架结构的差异， 第第3位数字为顺序号，用以区别基团、交联剂等的不同。位数字为顺序号，用以区别基团、交联剂等的不同。 为了区别凝胶型和大孔型离子交换树脂，在全名前加为了区别凝胶型和大孔型离子交换树脂，在全名前加 “D”表示表示 大孔型树脂。凝胶大孔型树脂。凝胶 型树脂，在型号后面用型树脂，在型号后面用“x”号联接阿拉伯数号联接阿拉伯数 字，表示交联度。国内生产的树脂仍沿用习惯命名。字，表示交联度

43、。国内生产的树脂仍沿用习惯命名。 62 命名 63 64 如如0117，表示强酸性丙烯酸系阳离子交换树脂，其，表示强酸性丙烯酸系阳离子交换树脂，其 交联度为交联度为7。 国外一些产品用字母国外一些产品用字母C代表阳离子树脂（代表阳离子树脂（C为为cation的的 第一个字母），第一个字母），A代表阴离子树脂（代表阴离子树脂（A为为Anion的第一的第一 个字母），如个字母），如Amberlite的的IRC和和IRA分别为阳树脂和分别为阳树脂和阴阴 树脂树脂，亦分别代表阳树脂和阴树脂。，亦分别代表阳树脂和阴树脂。 65 66 n饱和溶液饱和溶液：在一定温度下，向一定量溶剂里加入某种溶质，在一定温

44、度下，向一定量溶剂里加入某种溶质， 当溶质不能继续溶解时，所得的溶液叫做这种溶质的饱和溶当溶质不能继续溶解时，所得的溶液叫做这种溶质的饱和溶 液液 n过饱和溶液过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶 液称之为过饱和溶液；液称之为过饱和溶液； q溶质只有在过饱和溶液中才能析出；溶质只有在过饱和溶液中才能析出； 结晶的基本原理结晶的基本原理 67 溶液的过饱和与超溶解度曲线溶液的过饱和与超溶解度曲线 溶解度曲线溶解度曲线 过饱和曲线过饱和曲线 稳定区稳定区不可能结晶不可能结晶 介稳区介稳区不会自发地不会自发地 产生晶核。产生晶核。 不稳区不稳区能自发产生能自发产

45、生 晶核晶核 。 结晶的结晶的TC关系图关系图 68 A 稳定区：稳定区： 不饱和区不饱和区 B 第一介稳区：加入晶种结晶会生长，但不产第一介稳区：加入晶种结晶会生长，但不产 新晶核，养晶区新晶核，养晶区 C 第二介稳区：加入晶种结晶会生长，同时有第二介稳区：加入晶种结晶会生长，同时有 新晶核产生，新晶核产生，刺激结晶区刺激结晶区 D 不稳区：瞬时出现大量微小晶核，发生晶核不稳区：瞬时出现大量微小晶核，发生晶核 泛滥泛滥 69 曲线提示 结晶过程应尽量控制在介稳区内进行，以得到平均粒结晶过程应尽量控制在介稳区内进行，以得到平均粒 度较大的结晶产品，避免产生过多晶核而影响最终度较大的结晶产品，避免产生过多晶核而影响最终 产品的粒度。产品的粒度。 70 起晶方法 n自然起晶自然起晶 n刺激起晶刺激起晶 n晶