细胞生物学3研究方法02

1、基基 因因 敲敲 除除 基基 因因 敲敲 除除 示示 意意 图图 （1 1） 基基 因因 敲敲 除除 示示 意意 图图 （2 2） 基基 因因 敲敲 除除 原原 理理 Knockout Mice 未未 来来 的的 生生 物物 技技 术术 Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana C. elegans Zebrafish 免疫胶体金技术 基本原理：基本原理： 氯金酸氯金酸(HAuCl4)在在还原剂还原剂作用下，可作用下，可聚聚合成一合成一 定大小的金定大小的金颗颗粒，形成粒，形成带负电带负电的疏水的疏水

2、胶状胶状溶液。溶液。 由由于静电于静电作用而作用而成为稳定成为稳定的的胶体状态胶体状态，故，故称胶称胶 体体金。金。 胶体金标记胶体金标记：实质上是蛋白质等实质上是蛋白质等高分子被吸附高分子被吸附 到到胶体胶体金金颗颗粒表面的粒表面的过过程。程。 吸附吸附机机理：理：因因胶体胶体金金颗颗粒表面粒表面负电负电荷，荷， 与蛋白质与蛋白质的正的正电荷基团电荷基团因因静电静电吸附而形吸附而形 成牢固成牢固结结合。用合。用还原还原法可以方便地法可以方便地从氯从氯 金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。 应用应用：胶体胶体金粒子金粒子对蛋白质对蛋白质有很有很强强的吸的吸 附功能

3、，可以附功能，可以与与葡萄球菌蛋白、免疫葡萄球菌蛋白、免疫 球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、 激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结结合，合， 因而在因而在基础基础研究和研究和临床试验临床试验中成中成为非常为非常 有用的工具。有用的工具。 免疫免疫胶体胶体金金标标定定(Immunogold labeling) 利用了利用了胶体胶体金金颗颗粒具有高粒具有高电子电子密度的特密度的特 性，在性，在蛋白质与蛋白质与金粒子金粒子结合处结合处，在，在显微显微 镜镜下可下可见见黑褐色黑褐色颗颗粒。因此，可以粒。因此，可以观观察察 蛋白质蛋白质的分布

4、的分布区区域。域。 在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出 的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技 术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人 为改变培养条件为改变培养条件( (如物理、化学、生物等外界因素如物理、化学、生物等外界因素 的变化的变化) )即可进一步观察细胞在单因素或多因素的即可进一步观察细胞在单因素或多因素的 影响下的生理功能变化。影响下的生理功能变化。 细胞培养细胞培养 人的细胞培养人的细胞培养 细胞系细胞系: : 原代培养物经首次传代成功后即

5、为细胞系，有原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有 无限的传代能力。无限的传代能力。 细胞株细胞株: : 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、 具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的 传代能力。传代能力。 原代培养：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立原代培养：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立 即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的 培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质 植物组织培养

6、植物组织培养 植物原生质体培养植物原生质体培养 植物组织培养植物组织培养 外植体外植体愈伤组织愈伤组织新植株新植株 来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需 的物质的物质(如供能系统和酶反应体系等如供能系统和酶反应体系等)组成的体系即为非细胞体系组成的体系即为非细胞体系 近年来非细胞体系在研究近年来非细胞体系在研究DNA复制、复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输 机制以反细胞核装配机制以反细胞核装配(包括染色质装配、核膜装配及核骨架的装配包括染色质装配、核

7、膜装配及核骨架的装配)等。等。 概念概念 流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物 颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现 代细胞分析技术。代细胞分析技术。 流式细胞仪流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、 细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪细胞荧光化

8、学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪 器。器。 原理：原理： 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品 压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘 液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕 着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被 下单行排列，依次通过检测区域。下单行排列，依次通过检测区域。 Fluoresce

9、nce Activated Cell Sorting 488 nm laser +- Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 细细 胞胞 分分 选选 细细 胞胞 标标 记记 染染 色色 体体 分分 选选 染染 色色 体体 标标 记记 FACSAria 科研型 流式细胞仪检测范围 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞结构 特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性 激素结合位点 细胞受

10、体 细胞功能 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 光学系统光学系统 激光光源激光光源 光收集系统光收集系统 液流系统液流系统 流动室流动室 液流驱动系统液流驱动系统 电子系统电子系统 光电转换光电转换 数据处理系统数据处理系统 细胞分选系统细胞分选系统 细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域， 主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学 的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改 变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大

11、量培养 和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本 身。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、身。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、 染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组 织培养。织培养。 细胞工程细胞工程 在自发或人工诱导下，在自发或人工诱导下， 两个不同基因型的细胞两个不同基因型的细胞 或原生质体融合形成一或原生质体融合形成一 个杂种细胞。基本过程个杂种细胞。基本过程 包括细胞融合形成异核包括细胞融合形成异核 体体(heterokaryon)、异核、异核 体通过细胞有丝分裂进体通过细胞有丝分裂

12、进 行核融合、最终形成单行核融合、最终形成单 核的杂种细胞。核的杂种细胞。 细胞融合细胞融合 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程）法细胞融合过程 显微镜下细胞融合过程显微镜下细胞融合过程 BHK-21细胞用核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果细胞用核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果 IF：中间纤维；：中间纤维；g:金颗粒；金颗粒；N:核区核区 外周血血细胞扫描电镜标本的制备外周血血细胞扫描电镜标本的制备 取血取血-PBS洗三次洗三次-滴片滴片(有有Formvar膜膜)-冷的冷的 1%戊二醛戊二醛4度固定度固定2小时小时-PBS-1%四氧化锇，四氧化锇， 30分分-PBS-50、7

13、0、90%丙酮各一次，丙酮各一次，100% 两次两次-50、70、90%醋酸异戊酯丙酮溶液各一次，醋酸异戊酯丙酮溶液各一次， 100%醋酸异戊酯两次醋酸异戊酯两次-临界点干燥临界点干燥-喷碳、喷碳、 金金观察观察 人类血细胞人类血细胞SEM照片照片 GFP是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现 的。在蛋白质编号的。在蛋白质编号lema中可以看到中可以看到GFP发色团的骨架在发色团的骨架在 左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的 一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒一部分直接从

14、中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒 的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响 GFP的的 纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳 光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸 收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。 绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的应用 绿色荧光蛋白是当代科学和医学领域最重绿色荧光蛋白是当代科学和医学领域最重 要的工具之一，它从显微水平上照亮了生要的工具之一，它从显微水平上照亮了

15、生 命命 。 随着病毒在宿主体内不断扩散，你就可以通过跟踪发出的绿随着病毒在宿主体内不断扩散，你就可以通过跟踪发出的绿 光来观察病毒的扩散途径，或者你把它接合到一种蛋白质上光来观察病毒的扩散途径，或者你把它接合到一种蛋白质上 并通过显微镜观察它在细胞内部的移动并通过显微镜观察它在细胞内部的移动 科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑神经细科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑神经细 胞的发育过程。胞的发育过程。 绿色荧光蛋白的发现下村修 1962年首先从水母年首先从水母 中分离绿色荧光蛋中分离绿色荧光蛋 白的科学家，他发白的科学家，他发 现这种蛋白在紫外现这种蛋白在紫外 线光中呈现亮色。线光中呈现亮色。 1992

16、年，道格拉斯年，道格拉斯 普瑞金拿到了绿色普瑞金拿到了绿色 荧光蛋白的基因。荧光蛋白的基因。 绿色荧光蛋白的推广马丁-查尔 菲 1993年，马丁年，马丁查尔查尔 菲成功地通过基因菲成功地通过基因 重组的方法使得除重组的方法使得除 水母以外的其他生水母以外的其他生 物物(如大肠杆菌等如大肠杆菌等) 也能产生绿色荧光也能产生绿色荧光 蛋白，证实了绿色蛋白，证实了绿色 荧光蛋白与活体生荧光蛋白与活体生 物的相容性。物的相容性。 绿色荧光蛋白的改造钱永健 进行了大刀阔斧的化学进行了大刀阔斧的化学 改造，不但大大增强了改造，不但大大增强了 它的发光效率，还发展它的发光效率，还发展 出了红色、蓝色、黄色出

17、了红色、蓝色、黄色 荧光蛋白，使得荧光蛋荧光蛋白，使得荧光蛋 白真正成为了一个琳琅白真正成为了一个琳琅 满目的工具箱，供生物满目的工具箱，供生物 学家们选用。学家们选用。 绿色荧光蛋白质在科学研究和艺术领域发挥绿色荧光蛋白质在科学研究和艺术领域发挥 作用的美丽而令人惊讶的例子。作用的美丽而令人惊讶的例子。 3 3位诺贝尔奖得主第一次分离出的荧光基因，就是从上面照片中的这位诺贝尔奖得主第一次分离出的荧光基因，就是从上面照片中的这 种水晶水母体内获得的种水晶水母体内获得的。 水晶水母水晶水母 图片中的小老鼠是图片中的小老鼠是1997年年7月在大阪大学降生的，它们是第一种能够月在大阪大学降生的，它们

18、是第一种能够 在夜里发光的哺乳动物。研究人员可利用荧光老鼠研究胎儿发育。在夜里发光的哺乳动物。研究人员可利用荧光老鼠研究胎儿发育。 会发光的老鼠会发光的老鼠 杰夫杰夫利希曼利希曼(Jeff Lichtman)之手，展现了大脑内的连接，图片之手，展现了大脑内的连接，图片 中美丽的中美丽的“彩虹彩虹”就是神经系统网络。就是神经系统网络。 脑内连接脑内连接 这两只荧光猪诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学的实验室。这两只荧光猪诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学的实验室。 它们的发光本领并不是转基因技术的直接产物，而是从其经过基因它们的发光本领并不是转基因技术的直接产物，而是从其经过基因 改造的母亲

19、那里遗传而来。改造的母亲那里遗传而来。 两只荧光猪 发红光的猫发红光的猫 左侧的猫由韩国研究人员左侧的猫由韩国研究人员2007年晚些时候打造，能够在紫外线下年晚些时候打造，能够在紫外线下 发出红光。某些情况下，这些荧光蛋白基因可用作一种分子开关，发出红光。某些情况下，这些荧光蛋白基因可用作一种分子开关， 触发其它细胞活动触发其它细胞活动 GFP宾尼兔宾尼兔 荧光兔荧光兔“阿尔巴阿尔巴”(Alba)。阿尔巴是在转基因技术帮助下。阿尔巴是在转基因技术帮助下 拥有这种荧光基因的。拥有这种荧光基因的。GFP宾尼兔宾尼兔的问世在世界上引的问世在世界上引 发不小争议。发不小争议。 蝌蚪也发光蝌蚪也发光 荧

20、光鱼荧光鱼 在约克镇科技公司将荧光鱼引入市场后不久，荧光蛋白便在约克镇科技公司将荧光鱼引入市场后不久，荧光蛋白便 迅速在商业上得到应用。迅速在商业上得到应用。 绿色荧光蛋白质可以帮助科学家了解细胞机制如绿色荧光蛋白质可以帮助科学家了解细胞机制如 何工作。利用转基因技术，所有细胞和动物都可何工作。利用转基因技术，所有细胞和动物都可 以产生荧光蛋白质以产生荧光蛋白质。 康涅狄格学院化学家、康涅狄格学院化学家、发光基因发光基因作者马作者马 克克齐默齐默(Mark Zimmer)将绿色荧光蛋白质称之将绿色荧光蛋白质称之 为为“21世纪的显微镜世纪的显微镜”。通过让基因携带绿色荧。通过让基因携带绿色荧 光蛋白质光蛋白质与瘤转移或大脑功能有关的基因与瘤转移或大脑功能有关的基因 科学家只需通过寻找荧光便可知道基因何时以科学家只需通过寻找荧光便可知道基因何时以 及为什么及为什么“开启开启”。 细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、