分解纤维素的微生物的分离 上课用

1、 教学目标教学目标: 1、知道纤维素酶的种类及作用、知道纤维素酶的种类及作用 2、初步掌握从土壤中分离出分解纤维、初步掌握从土壤中分离出分解纤维 素的微生物的实验方法素的微生物的实验方法 纤维二糖纤维二糖 C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素 真菌、放线菌及细菌真菌、放线菌及细菌 纤维素酶纤维素酶 下列生物能分解纤维素的是（下列生物能分解纤维素的是（ ） 人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纤维杆菌纤维杆菌 A. B. C. D. C 兔、牛等草食性动物的肠胃中的共生微生物可兔、牛等草食性动物的肠胃中的共生微生物可 合成纤维素酶分解纤维素。合成纤维素酶分解纤维

2、素。 蘑菇、纤维杆菌能分泌纤维素酶分解纤维素；蘑菇、纤维杆菌能分泌纤维素酶分解纤维素； 人不能消化纤维素。人不能消化纤维素。 在一支试管中添加纤维素酶，在一支试管中添加纤维素酶， 另一支试管不添加纤维素酶；另一支试管不添加纤维素酶； 思考思考1P27的小实验是如何构成对照的？的小实验是如何构成对照的？ 滤滤 纸纸 崩崩 溃溃 法法 4 4、纤维素酶活性的测定实验：、纤维素酶活性的测定实验： 方法：滤纸崩溃法方法：滤纸崩溃法 （二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选 1、筛选纤维素分解菌的方法、筛选纤维素分解菌的方法_。 优点：该方法可以通过优点：该方法可以通过_反应直接筛选。反应直接筛

3、选。 刚果红染色法刚果红染色法 颜色颜色 2、其原理是：、其原理是：刚果红刚果红可以与可以与纤维素纤维素形成形成 _，当纤维素被，当纤维素被_分解后，分解后， 红色复合物无法形成，出现以红色复合物无法形成，出现以_ 为中心的为中心的_，可以通过，可以通过_ 来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。 红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶 纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈 可根据是否可根据是否 产生产生透明圈透明圈 来筛选纤维来筛选纤维 素分解菌素分解菌 透明圈大的，透明圈大的， 分解纤维素的分解纤维素的 能力就强啦能力就强啦 练一练：练一练： 1、下列关于纤维素

4、酶的说法，错误的是、下列关于纤维素酶的说法，错误的是 A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖 2、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌， 下列说法错误的是下列说法错误的是 A、刚果红能与纤维素形成红色复合物、刚果红能与纤维素形成红色复合物 B、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C、刚果

5、红不能与葡萄糖形成红色复合物、刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物 D、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出 了纤维素分解菌了纤维素分解菌 ( (三三) )、实验设计、实验设计 土壤土壤 取样取样 选择选择 培养培养 梯度梯度 稀释稀释 将样品涂将样品涂 布到鉴别布到鉴别 培养基培养基 挑选挑选 菌落菌落 什么样什么样 的环境的环境 取样取样? 培养的目的培养的目的? ? 选择培养基的选择培养基的 特点特点? ? 挑选什挑选什 么样的么样的 菌落菌落? ? 鉴别培养基鉴别培养基 的特点的特点? ? 如何鉴别如何鉴别? ? 根据根据：微生物：微生物 对生存环

6、境的对生存环境的 要求，到相应要求，到相应 环境中去找；环境中去找； 目的：目的：增加纤维素增加纤维素 分解菌的浓度，分解菌的浓度，以以 确保能够从样品中确保能够从样品中 分离到所需要的微分离到所需要的微 生物；生物； 刚果红染色法刚果红染色法 ( (三三) )、实验设计、实验设计 土壤土壤 取样取样 选择选择 培养培养 梯度梯度 稀释稀释 将样品涂将样品涂 布到鉴别布到鉴别 培养基培养基 挑选挑选 菌落菌落 旁栏思考旁栏思考1本实验流程与尿素分本实验流程与尿素分 解菌的分离实验流程有哪些异同？解菌的分离实验流程有哪些异同？ 尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的尿素分解菌的分离实验流程是将土

7、样制成的 菌悬液直接涂布在选择培养基上；菌悬液直接涂布在选择培养基上； 本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布 在鉴别培养基上。其它操作基本基本相同。在鉴别培养基上。其它操作基本基本相同。 选择纤维素丰富的环境选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落，如树林中多年落 叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维生物与环境的互相依存关系，在富含纤维 素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因 此从这种土壤中此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于获得目

8、的微生物的几率要高于 普通环境普通环境 旁栏思考旁栏思考2 取样的环境是怎样的，作出这取样的环境是怎样的，作出这 种选择的理由是什么？种选择的理由是什么？ 根据根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找； 【资料一资料一】土壤取样土壤取样 人工设置适宜环境，使纤维人工设置适宜环境，使纤维 素分解菌相对聚集。素分解菌相对聚集。 将纸埋于深约将纸埋于深约10cm的腐殖土的腐殖土 壤中。壤中。 旁栏思考旁栏思考3 将滤纸埋在土壤中有什么作用？将滤纸埋在土壤中有什么作用？ 你认为滤纸应该埋进土壤多深？你认为滤纸应该埋进土壤多深？ 选择培养的选择培养的 【资料

9、二资料二】选择培养选择培养 培养基成分分析培养基成分分析 培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质 纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源） NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐 KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g 无机盐无机盐 酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、生长因子、碳源碳源、氮源、氮源 水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子 溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水 有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能

10、分解纤维素的微生物可以大量繁殖。分解纤维素的微生物可以大量繁殖。 （2）若设置一个对照实验说明选择培养）若设置一个对照实验说明选择培养 的作用，应控制的变量是将的作用，应控制的变量是将_ 改为改为_。 C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基 的作用？的作用？ 葡萄糖葡萄糖 纤维素粉纤维素粉 用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照 答：（答：（1）自变量为培养基的种类，即普通）自变量为培养基的种类，即普通 培养基和选择培养基培养基和选择培养基 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应在选择培养的条件下，可以使那些能够适应 这种营养条件的

11、微生物得到迅速繁殖，而那这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那 些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑 制，因此可以起到制，因此可以起到“浓缩浓缩”的作用的作用 旁栏思考旁栏思考4 为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？ 【资料三资料三】刚果红染色法刚果红染色法 方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果先培养微生物，再加入刚果 红进行颜色反应红进行颜色反应 方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红在倒平板时就加入刚果红 漂洗作用漂洗作用,氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去,这这 样就留下大大

12、小小的透明圈样就留下大大小小的透明圈,大的透明圈当然分解大的透明圈当然分解 纤维素的能就强。纤维素的能就强。 方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？ 培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质 CMC-Na 510g 碳源碳源 酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子 KH2PO4 0.25g无机盐无机盐 土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子 琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂 上述物质溶解后，加蒸上述物质溶解后，加蒸 馏水定容至馏水定容至1000mL 氢元素、氧元素氢元素、氧元素 鉴别鉴别纤维素分解菌的培养基纤维素分解菌的培养基 (水溶性羧

13、甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠) 染色法染色法优点优点缺点缺点 颜色反应基颜色反应基 本上是纤维本上是纤维 素分解菌的素分解菌的 作用作用 操作繁琐操作繁琐 刚果红会使菌落之间发刚果红会使菌落之间发 生混杂生混杂 操作简便操作简便 不存在菌落不存在菌落 混杂问题混杂问题 产生淀粉酶的微生物产生淀粉酶的微生物 也产生模糊透明圈，也产生模糊透明圈， 有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素， 形成明显的透明圈。形成明显的透明圈。 思考：这两种方法各有哪些优点与不足思考：这两种方法各有哪些优点与不足 方法一：方法一：先先 培养微生物，培养微生物， 再加入刚果再加入刚果 红进行颜色红进行颜色 反应

14、反应 方法二：方法二：在在 倒平板时就倒平板时就 加入刚果红加入刚果红 挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落 挑取产生挑取产生明显的透明圈的菌落，明显的透明圈的菌落， 一般即为分解纤维素的菌落。一般即为分解纤维素的菌落。 接种到接种到纤维素分解菌的纤维素分解菌的选择选择培养培养 基上，在基上，在30300 0C C37370 0C C培养，可获得纯培养，可获得纯 培养。培养。 练一练练一练 1、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪 一生物学观点？（一生物学观点？（ ） A.生物结构与功能相适应的观点生物结构与功能相适应的观点 B

15、.生物结构与功能整体性观点生物结构与功能整体性观点 C.生物与环境相适应的观点生物与环境相适应的观点 D.生物发展进化的观点生物发展进化的观点 2、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（ ） 土壤取样土壤取样 梯度稀释梯度稀释 选择培养选择培养 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落挑选出单个菌落 A、 B、 C、 D、 3、有关选择培养正确的叙述是（、有关选择培养正确的叙述是（ ） A、可以增加纤维素分解菌的浓度、可以增加纤维素分解菌的浓度 B、可以减少纤维素分解菌的浓度、可以减少纤维素分解菌的浓度 C、所用培养基是固体培养基、所用培养基是固体培养基

16、 D、所用培养基是平板培养基、所用培养基是平板培养基 C B A 四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选 出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明 培养基制作合格。培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得 了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。 2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌 的数

17、量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取 土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌 等不同的分离结果。等不同的分离结果。 1.为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为了确定分离得到的是纤维素分解菌， 还需要进行还需要进行_实验，纤维素酶的实验，纤维素酶的 发酵方法有发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。发酵。 2.2.纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等 纤维素所产生的纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。 发酵产纤维素酶发酵产纤维素

18、酶 液体液体 固体固体 五、课题延伸五、课题延伸 分解分解 纤维纤维 素的素的 微生微生 物的物的 分离分离 纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化种类、作用、催化 刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理 实实 验验 设设 计计 土壤取样土壤取样 选择培养选择培养 涂布培养涂布培养 纯化培养纯化培养 前置染色法前置染色法 后置染色法后置染色法 富含纤维素土壤富含纤维素土壤 增大分解菌含量增大分解菌含量 染色鉴别染色鉴别 分离出分解菌分离出分解菌 课堂总结课堂总结 比较项目比较项目 分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌 选选 择择 培培 养养 基基 原理原理 培养基培养基 类型类型 目的

19、目的 鉴鉴 定定 培培 养养 基基 原理原理 现象现象 方法方法 将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有 尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择 培养基上培养基上 将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有 纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的 选择培养基上选择培养基上 固体培养基固体培养基 液体培养基液体培养基 筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养,浓缩所需微生物浓缩所需微生物 比较比较 项目项目 分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌 选选 择择 培培 养养 原理原理 培养基类培养基类 型型 目的目的 鉴鉴 定定 培培 养养 基基 原原 理理 现现 象象 方方 法法 在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素

20、的化学反应 中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基 的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培 养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如 果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红 刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成 红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被 纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基 上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解 菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈 观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的 环带出现来鉴定尿素分解菌

21、环带出现来鉴定尿素分解菌 观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现 透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌 脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法 【练一练练一练】 有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些 微生物的研究和作用，使人们能够利用秸秆等微生物的研究和作用，使人们能够利用秸秆等 废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。 研究人员用化合物研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微、硝酸盐、磷酸盐以及微 量元素配制的培养基，成功的筛选到能产生纤量元素配制的培养基，成功的筛选到能产生纤 维素酶的微生物

22、。分析回答问题。维素酶的微生物。分析回答问题。 (1)培养基中加入的化合物培养基中加入的化合物A是是_，为微，为微 生物的生长提供生物的生长提供_，这种培养基属于，这种培养基属于 _培养基。培养基。 (2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培 养基中加入养基中加入_。 纤维素纤维素 碳源碳源 选择选择 刚果红刚果红 (3)在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可 用液体培养基培养，增加微生物的浓度。为获得用液体培养基培养，增加微生物的浓度。为获得 纯净的菌株，常采用平板划线的方法进行接种，纯净的菌株，常采用平板划线的方

23、法进行接种， 此过程所用的接种工具是此过程所用的接种工具是_，操作时采，操作时采 用用_灭菌的方法；还可用灭菌的方法；还可用_ 的的 方法接种。方法接种。 (4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌 处理后才能倒掉，这样做的目的是处理后才能倒掉，这样做的目的是 _。 接种环接种环 灼烧灼烧稀释涂布平板稀释涂布平板 防止造成环境污染防止造成环境污染 20092009年年40.40.【生物生物选修选修1 1生物技术实践生物技术实践】（1515分）分） （1 1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外， 还要考虑还要考

24、虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌和渗透压等条件。由于该细菌 具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、 _等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 （2 2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染， 需对培养基和培养皿进行需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操（消毒、灭菌）；操 作者的双手需要进行清洗和作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌；静止空气中的细菌 可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还 能能

25、_。 温度温度酸碱度酸碱度 易培养易培养 生活周期短生活周期短 灭菌灭菌 消毒消毒 损伤损伤DNADNA的结构的结构 链接高考链接高考 （3 3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数， 要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多 次重复外，还应保证待测样品稀释的次重复外，还应保证待测样品稀释的_。（。（4 4） 通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小 等菌落特征对细菌进行初步的等菌落特征对细菌进行初步的_。（。（5 5）培）培 养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。 对于固体培养基应采用的检测方法是对于固体培养基