一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项

1、文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟： “想拿高分 文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话： “是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉 献给小师弟你了。 ”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的 教诲 免疫组化，免疫组织化学技术（ immunohistochemistry ），是 一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确 定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组 化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石 蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对 组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组

2、织抗原暴露有影 响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作 方法。 免疫组化步骤详解 免疫组化结果分析很多时候，我 们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不 知道如何正确地分析， 得出理想的结果。 这实在是一件憾事。 如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳 性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性 着色细胞计数法和评分法。 前者是在 40* 光镜下， 随机 10 个 视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色 程度（0分阴性着色， 1分淡黄色， 2分浅褐色， 3分深褐色） 和阳性范围（ 1分0-25%，2分 26-50%，3分 51-7

3、5%，4分 76-100%）评分，最终分数相加。免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝 技。1. 对照染色 和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立 对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照 一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身 对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照 就足够了。2. 定位 抗原表达必须在特定部位。如 LCA 应定位在细胞膜上； CK 应定位在细胞浆内； PCNA 及 p53 蛋白应定位在细胞核内等 等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结 果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？ 这就要

4、用到上一段提到的对照染色了。3. 半定位 现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没 有那么高大上的话， 就只好赶鸭子上架， 用肉眼定一下量了。 因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的 半定量一般就分为三级：弱（ +），中（ + ），强（ + ）。以 绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（ +）=1，中（ +） =2，强（ +） =3。 至少随机观察 5-10个HPF。然后根据（+） % x 1 + （ +） % x 2 +（ + ）% x 3 计算出数值；总数值 1.5 者为 （+）。 4. 图像分析仪 如果要进行精确定量的话，就要用

5、到图像分析仪。图像分析 仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重推荐 的是一款图像分析软件：Image J。毛博当年在米国做博士猴 的时候，就是用的这款软件。这是 NIH 开发的免费软件。一 般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到 了 1.50 版。网上可以免费下载。其界面非常简洁，如下图所 示。现在，根据一个实例来看看如何用 Image J 来进行图像 分析。如下图所示， 我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。 那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？首先，要把彩 色的图像转换成黑白图像。步骤如下：Image宀Type宀16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分

6、用高亮标示出来。步骤 如下：Image宀Adjust宀Threshold。然后拖动鼠标，直到所有 的细胞被标示出来。有时候 2 个细胞靠得比较紧密，会被计 数为 1 个细胞。这个时候可以采用 Image J 的水洗功能。步 骤如下：Image宀Binary宀Watershed。如下图的蓝色箭头所示， 这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地 被计数成了 2 个细胞。然后，就可以正式开始分析了。步骤 如下：Analyze宀Analyze Particles。在得出最后的结果之前， 还有一些选项需要选择。 如果想要计数全部的细胞， 那么 Size 项里面选择 “O-infinity ”

7、 Circularity 的默认值为 “ 0.00-1.00” 一般就取默认值。最后的结果如下图所示。软件自动测量了 每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞 的面积。然后计数了一共有 72个细胞，总面积为 21286.00， 平均大小为 295.64。免疫组化是个苦活，时间长，步骤多， 还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片 子，最后都希望得出自己想要的结果。以上，毛博介绍了一 些自己的心得体会。希望广大的实验狗们都能做出自己想要 的结果，早点发文章。 非特异性染色的八大原因然而，结 果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种状况，好好的 一张片子染得脏脏的， 这就是

8、最常见的非特异性染色。 1. 抗 体问题，真的是一分钱一分货啊！ 一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度， 高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。 单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。尤其是背景非特异性 染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯 具，所以要注意抗体的有效期。2. 抗体浓度过高 /孵育时间过长一抗浓度太高也是出现非特 异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新 抗体前应该多做预实验，摸索出最理想的工作浓度，不能简 单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。加上抗体后，立刻调好定时器，提 醒自己及时终止反

9、应，就会避免这个问题。3. DAB 染色时间太长 /变质 DAB 的孵育时间过长， 会造成背 景非特异性染色。 DAB 的显色时间不是一成不变的， 主要靠 自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马 上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕 色的时间过长， 表明抗体浓度过低。 DAB 要保存于避光干燥 的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。图1就冲洗的有些晚了；图 2 就是刚刚好，染色效果棒棒哒 !4. 内源性酶和 生物素内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是一 些内源性酶生物素含量丰富的组织， 如肝脏， 肾脏，脾脏等。 处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法

10、是将左旋咪 唑(24 mg/mL )加入底物液中，并保持 PH值在7.6-8.2，即 能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用 50 mmol/L 的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用 0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片浸 于25卩g/mL亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后即 可染色。也可以 24 mg/mL 的卵白素封片 15 分钟。5. 组织变干 一下子染太多片子的时候，容易出现这种情况。解决的办法 就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆 盖组织，超出组织边缘 2 mm。然后用PAP笔在组织周围画 一个圈圈，把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该 距离组织边缘 3-4 mm 。6. 浸泡时间过长 切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。这都 是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。毛博的独 门秘技就是 4C 冰箱。只要把容器放在 4C 冰箱里，过夜 完全没有问题。7. 清洗不充分清洗一定要充分。 PBS 液一定要双蒸水新配，用之前再次测PH 值。缓冲液用 0.05 mol/L 的 Tris-HCL ，0.15 mol/L 的 NaCl 即可。如果加一点去垢剂 Tween-20 就更好了。8. 封闭血