细胞生物学技术PPT学习教案

1、会计学1细胞生物学技术细胞生物学技术示踪：向生物体内引入示踪剂标本制备：根据实验要求将动物之城整体标本，或制成组织切片。细胞涂片自显影制备，在暗室中将制备好的标本与感光片贴合曝光活在切片上涂覆一层原子核乳剂曝光加工处理，在暗室内将以感光的胶片显影、定影、水洗肉眼观察或镜下观察放射自显影技术的一般步骤放射自显影技术的一般步骤第1页/共30页自显影的过程：u 感光材料中的溴化银在核射线作用下释放出电子 AgBr+ Ag+Br+e-u 该电子被带正电的银离子俘获 e+Ag+Agu 许多带正电荷的银离子被还原，在溴化银分子中形成潜影 Ag.Ag nAgu 经显影、定影处理，还原为金属银并显示出影像第2

2、页/共30页其应用范围 一、宏观标本（宏观自显影术 M-ARG） 包括整体自显影、硬组织磨片自显影、宏观立体标本自显影及各种的色谱、电影普和免疫沉淀版自显影等。 宏观自显影观察范围较大、分辨率要求较低，只能用肉眼或放大镜观察，根据标本黑度（光密度）判断失踪的部位和定量。二、显微放射自显影LM-ARG 浸蘸法 覆盖法 剥膜法第3页/共30页影响放射自显影结果的几个主要因素：1. 核乳胶的选择 根据观察所用手段及所用核素放射粒子的性质、能量来选择适宜的 乳胶型号。2. 温度 核乳胶要储存于4冰箱内，温度高时增加本底雾点缩短使用期限。3. 湿度 在曝光过程中要保持乳胶干燥。4. 曝光环境中的气体 潜

3、影衰退的主要原因是在潮湿的环境下曝光，是还原的银颗粒又被氧化，在显影后导致黑色银颗粒减少。5. 曝光时间 由于核素在组织细胞内渗入量对使核素乳胶感光来说是很少的，能量也低。6. 核素的用量问题 根据实验的目的及要求考虑用量问题。第4页/共30页放射自显影在生物学中的应用放射自显影在生物学中的应用将125I注入体内可观察碘在甲状腺内的碘化部位及过程把3H标记的胸腺嘧啶苷或氨基酸注入体内，可以研究细胞内DNA合成及蛋白质合成及其代谢过程第5页/共30页Autoradiogram (A) of a rat dosed with a 14C-labelled compound. High levels

4、 of labelled substance are present in lung tissue and bronchi, liver and kidney. The accumulated substance in the kidney is confined to the proximal tubules. Enlarged details of lung, liver and kidney are shown in B, C and D.第6页/共30页小鼠全身被3H标记后，一夜之后在可视化成像仪下成像整体切片放射自显影术能在同一自显影偏上比较药物或毒物在各器官组织内的分布强度，不同时

5、间的分布、转运、蓄积、排泄等代谢动态，目前已被广泛应用于对药物和毒物的研究上。第7页/共30页放射自显影术在细胞动力学中的应用是分裂细胞周期时间的测量完全革新放射自显影术在细胞动力学中的应用是分裂细胞周期时间的测量完全革新 通过细胞增殖周期的研究，发现绝大多数肿瘤细胞的增殖周期和相应的正常细胞是相同的，甚至还较长。通过细胞增殖周期的研究，发现绝大多数肿瘤细胞的增殖周期和相应的正常细胞是相同的，甚至还较长。第8页/共30页第9页/共30页Flow CytoMeter，FCMn是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多

6、个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。第10页/共30页技术特点：库尔特电阻库尔特电阻荧光荧光光散射光散射光吸收光吸收细胞体积细胞体积DNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量酶活性酶活性细胞膜受体细胞膜受体表面抗原表面抗原从而定量测定通过通过快速快速测定测定第11页/共30页1、制备细胞悬液，压入流动室5、细胞滴通过偏转电场分离，收集4、经显示器显示或打印3、将光信号转化为电信号和数字信号2、激光照射，产生散射光和荧光工作原理：第12页/共30页细胞培养新鲜组织石蜡包埋细胞分选表型测定单细胞悬液制备荧光抗体标记上机检测继续培养FISHP

7、CR统计学分析第13页/共30页流式细胞仪FACSCaliber临床型（台式机）特点：光路调节系统稳定自动化程度高操作简单使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析第14页/共30页科研型分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特性培养孔或板上适用于高速分选和多色分析FACSAria第15页/共30页 细胞生物学细胞生物学 免疫学免疫学 遗传学遗传学 药理学药理学 肿瘤肿瘤学学 血液学血液学 病理学病理学 临床临床检验检验 植物学植物学 海洋生物学海洋生物学第16页/共30页流式细胞细胞因子分析图第17页/共30页第18页/共30页第19页/共30页CD4FITC/

8、CD8PE/CD3PerCP三色标记T、CD4+T、CD8+T细胞亚群（confocal）第20页/共30页第21页/共30页u 将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能l 瞬时转染瞬时转染(transient transfection），DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达l 稳定稳定转染转染(stable transfection)，与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制第22页/共30页基因转染的基本方法分类化化学学病病毒毒物物理理DEAE葡聚糖磷酸钙共沉淀人工脂质体逆转录病毒逆转录病毒腺病毒腺病毒电穿孔法电穿孔法显微注射法显微注射法基因枪法基因枪法第23页

9、/共30页eg脂质体接到转染；外源质粒进入细胞的一般过程第24页/共30页显微注射法制备转基因小鼠第25页/共30页DNA病毒载体 n主要有腺病毒相关病毒载体，疱疹病毒载体。这一类是利用病毒载体介导的基因转移，以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤基因治疗的有效方法。对DNA病毒载体的研究是当前基因治疗研究中的重点领域。第26页/共30页病毒载体转染过程病毒载体转染过程第27页/共30页研究进展： 研究人员通过实验，发现了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(prot