郭俊涛毕业设计-2014-06-13最终版

1、 学号：20100146572014 届本科生毕业论文（设计）题 目：两种倍半萜内酯的结构修饰及细胞毒活性研究学院(系)： 理 学 院专业年级： 应用化学2010级学生姓名： 郭 俊 涛指导教师： 汤 江 江合作指导教师：完成日期： 二一四年六月目 录第一章 文献综述11.1倍半萜化合物的研究背景11.2两种倍半萜内酯的研究概况11.2.1 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的研究概况 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的化学合成 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的结构修饰31.2.2 小白菊内酯的研究概况 小白菊内酯的化学合成 小白菊内酯的结构

2、修饰：51.3 Heck反应的介绍61.4立题依据81.5研究目的及意义8第二章 实验部分92.1实验仪器92.2实验材料92.3 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和1，6-O，O-乙酰基大花旋覆花内酯的结构修饰92.3.1 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯6-OH的酯化修饰92.3.2 1，6-O，O-乙酰基大花旋覆花内酯13位环外双键的Heck偶联92.3.3 小白菊内酯13位环外双键的Heck偶联102.4实验结果与讨论102.5衍生物的细胞毒活性评价14第三章 探索部分153 .1探索带有杂环的碘代物与1-O-乙酰基大花旋覆花内酯进行反应的条件153 .2探索带有杂环的碘代物与小白菊内酯进行反

3、应的条件153 .3实验结果与讨论15第四章 结语与展望17参考文献18附录20致谢26两种倍半萜内酯的结构修饰及细胞毒活性研究作者 郭俊涛 指导教师 汤江江摘 要：1-O-乙酰基大花旋覆花内酯是从欧亚旋覆花中提取的一种倍半萜内酯类化合物，是中药旋覆花的活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用。目前，以该天然产物为原料，通过化学反应对其进行结构修饰的衍生物在细胞毒活性方面的研究也有一定的进展。小白菊内酯是中药野生甘菊的主要提取成分，属于倍半萜内酯类化合物，在多种肿瘤细胞中通过不同机制发挥抗癌作用，小白菊内酯对异常细胞有抑制作用的同时对正常的细胞无影响，这一特有的生物活性使其作为炎症和

4、癌症治疗药物具有潜在优势。本文以1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和小白菊内酯为原料，通过酯化反应和Heck偶联反应对二者进行结构修饰，得到十五个衍生物，通过1H NMR、13C NMR、ESI-MS和X-ray衍射等波谱方法对衍生物进行结构表征，随后对部分衍生物进行了细胞毒活性评价。结果发现：经6-OH结构修饰的衍生物的细胞毒活性比母体高，经13-环外双键结构修饰后衍生物的细胞毒活性比母体低，揭示了6-OH不是此类倍半萜内酯的活性基团，13-环外双键是此类倍半萜内酯的活性基团。关键词：1-O-乙酰基大花旋覆花内酯；小白菊内酯 ；Heck反应；细胞毒活性Structure modification

5、and cytotoxic activity studying of two sesquiterpene lactonesAuthor: Juntao Guo Supervisor: Jiangjiang TangAbstract:1-O-acetylbritannilactone is a sesquiterpene isolated from the medicinal plant Inula britannica, is one of the active ingredients of inula flower, have anti-inflammatory, antitumor, an

6、tibacterial and other pharmacological effects. Currently, the natural products act as raw material, through chemical reaction for structural modification of derivatives in cytotoxic activity research also made great progress. Parthenolide is the main Chinese medicine which extract from wild chamomil

7、e ,belongs to sesquiterpene lactone compounds, through different mechanisms play a role of anti-cancer in a wide variety of tumor cells, Parthenolide has inhibitory effect on abnormal cells at the same time had no effect on the normal cells, the unique biological activity as inflammation and cancer

8、treatment has the advantage of potential. Based on 1-O-acetylbritannilactone and Parthenolide as raw material, through the Heck coupling reaction of the 13 - outside a ring of the double bond for structural modification, get ten derivatives, by 1H NMR、13C NMR、ESI-MS and X - ray diffraction spectrum

9、method on derivatives for structural characterization, then the evaluation of cytotoxic activity for some derivatives. The results showed that: after sixth hydroxy structure modification derivatives cytotoxic activity is higher than the mother of derivatives, double bond by thirteenth outside ring s

10、tructure modified derivatives of cytotoxic activity is lower than the mother of derivatives, reveals the sixth hydroxy isnt the active group of sesquiterpene lactones, the thirteenth outside ring double bond is the active group of sesquiterpene lactones.Keywords: 1-O-acetylbritannilactone；Parthenoli

11、de；Heck reaction；cytotoxic activity两种倍半萜内酯的结构修饰及细胞毒活性研究第一章 文献综述1.1倍半萜化合物的研究背景目前，癌症是威胁人类健康的又一大凶手，是仅次于心脑血管疾病的第二大致死性疾病，严重地威胁人类的健康和生命。现在临床上应用的抗癌药物虽然种类不少，但价格昂贵，毒副作用大，且尚没有治疗某些癌症的特效药。因此寻找疗效确切，作用机理清楚，治愈率高，毒副作用小的抗癌药物，攻克癌症成为亟待解决的一大课题。植物在其漫长的进化过程中合成了许多结构各异的次生代谢产物，这些次生代谢产物不仅具有不同的生物活性，还常常被发现有新的作用机制，像紫杉醇、长春新碱、喜树碱

12、就是从植物中发现的三个效果很好的天然抗癌药物。这些天然药物的发现和在临床上的广泛应用，极大地推动了化学家和药学家对抗癌药物的研发，并极大地促进了病理学家和生物学家对抗癌作用机理的研究。据统计，目前使用的药物中，30%以上是天然化合物经结构修饰产生的，而临床上应用的抗癌药物74%来源于天然产物和天然产物的衍生物或是受到天然产物结构的启发而设计的合成药物。从包括植物在内的自然界中寻找发现高效低毒的抗癌活性成分或先导化合物一直是国内外十分关注的课题和研究的热点。1.2两种倍半萜内酯的研究概况1.2.1 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的研究概况旋覆花（Inula britanica L.）为菊科旋覆花属

13、植物，在我国资源十分丰富，东北、西北、华北、浙江等地都有分布，是常用中药，具有降气、消炎、行水、止呕的功效。根据2010年中国药典中的规定，日本旋覆花及欧亚旋覆花的干燥头状花序作为旋覆花正品药源1。旋覆花化学成分主要有甾醇类、黄酮类、倍半萜内酯和萜类化合物。1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的分子式C17H24O5( 化学结构式见图1) ，相对分子质量为308。现代药理学研究证明：1-O-乙酰基大花旋覆花内酯是菊科旋覆花属植物中一个具有抗肿瘤药理活性的倍半萜类天然产物。图1 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯（ABL）和1，6-O，O-乙酰基大花旋覆花内酯(OABL)的结构式 1-O-乙酰基

14、大花旋覆花内酯的化学合成2011年Peter Metz课题组36以3,4,5-三羟基-1-亚甲基-环己烷基-7-甲基-己酸为起始物，对其进行特定基团保护后，通过多步反应对大花旋覆花内酯进行了化学全合成(scheme 2)。Scheme 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的结构修饰目前对1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的结构修饰主要集中在6-位羟基的结构修饰：2000年，程永浩组8以1-O-乙酰基大花旋覆花内酯为原料，在CH2Cl2作为溶剂条件下，加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶，最后加入酰氯，室温条件下反应30min后，通过硅胶柱色谱纯化目标产物，产率可达90%以上(scheme 3)。S

15、cheme 3在中草药中，旋覆花也用于治疗哮喘，作为一味温和祛痰和除痰症的药物。至于哮喘，这是一种由于呼吸道感染引起的炎症，而根据文献报道，黄酮类化合物可以通过降低组胺水平，进而增强结缔组织2的免疫反应。某些黄酮类化合物如木犀草素和槲皮素都在减缓支气管类疾病中起到重要作用3,4,5。对于旋覆花来说，尽管在分子以及临床水平中对其抗哮喘的研究甚少，但是，从旋覆花中分离纯化得到的上述化学成分在其它报道中也具有此类活性。根据旋覆花在中医中的应用，设计了一项实验，即用LPS和PA使小鼠急性肝功能衰竭，测定小鼠的存活率。高浓度的旋覆花的上清液可以减轻小鼠的急性肝功能衰竭，从而增加存活率6。1-O-乙酰基大

16、花旋覆花内酯经6-位羟基乙酰化得到的1，6-O，O-乙酰基大花旋覆花内酯显示出了更高的抑制癌细胞增殖活性;吴一兵7用1-O-乙酰基大花旋覆花内酯为起始原料, 对其6位侧链进行修饰, 与相应的羧酸反应, 设计合成了萘普生衍生物(ABL-1)衍生物；程永浩等8选择了具有明显生理活性的脯氨酸为侧链, N-苯磺酰化后转化成酰氯, 再与ABL 进行“嫁接”, 合成了新化合物ABL-2、3、4、5、6 ，该课题组又将ABL的6 位羟基转化成了氨噻肟酸酯, 得到单乙酰大花旋覆花内酯氨噻肟酸酯ABL-7、8、9、10、11；刘守信9对ABL 进行衍生化, 合成了化合物ABL-12 （scheme 1）。Sch

17、eme 1表 1 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯及其衍生物具有众多的药理活性化 合 物 名 称生 物 活 性参 考 文 献ABL抑病菌活性黄瓜白粉病菌，黄瓜霜霉病菌黄瓜灰霉病菌，番茄早疫病菌抑真菌活性 致病疫霉10抑病菌活性 小麦赤霉病菌13抗肿瘤活性 肝癌细胞,人黑色素癌细胞 11,12OABL细胞毒活性 Bel-7402细胞7ABL-1抗炎活性 HL-60细胞7ABL-2-11抗肿瘤活性 HL-60细胞8ABL-12细胞毒活性 Bel-7402细胞, HL-60细胞9抗肿瘤活性 HT-29细胞141.2.2 小白菊内酯的研究概况小白菊内酯（Parthenolide）是中药野生甘菊( 银胶菊属

18、银胶菊 Parthenium hysterophorus) 的主要提取成分，它是倍半萜烯内酯的主要成分 15 。小白菊内酯的分 子式为C15H20O3( 化学结构式见图2)，相对分子质量为 248. 3。小白菊内酯含有-亚甲基-内酯环和环氧化物结构，这些结构可以和含有巯基基团的酶和其它功能蛋白反应，干扰细胞的许多关键生物过程，如细胞的信号传导途径，线粒体呼吸，增殖和凋亡等。这些反应可降低酶的活性，改变谷胱甘肽 (GSH)的代谢并引起细胞内氧化还原平衡状态的严重失衡。小白菊内酯的环氧亚甲基结构使其具有细胞毒性。一个世纪以来，墨西哥和印度人都将一种菊科植物作为草药来治疗头疼发烧、胃疼、牙疼及风湿性

19、关节炎等疾病16。后来研究发现，这种菊科植物中的有效成分是小白菊内酯( Parthenolide，PL) ，是一种倍半萜内酯类化合物。图 2 小白菊内酯（PL）的结构式 小白菊内酯的化学合成2012年，Chen Yue组34以2,6,10-三甲基-1,5,9-十一烯-1-醇为原料，经过多步化学反应，通过化学合成途径得到了小白菊内酯，产率为8.0%(scheme 4)。Scheme 小白菊内酯的结构修饰： 目前对小白菊内酯的结构修饰主要集中在13-位环外双键的结构修饰，包括化学修饰和生物修饰： 13-位化学修饰：2013年刘玉辉组16以小白菊内酯为原料，对其十三位

20、环外双键进行化学修饰得到二甲氨基-小白菊内酯( Dimethylamino-parthenolide，DMAPT) 。DMAPT 的化学结构式为scheme 5产物，该化合物是在小白菊内酯 13号碳原子上加了一个二甲氨基形成的，修饰后的化合物大大提高了其水溶性。同时，由于没有涉及到小白菊内酯生物活性位点的改变，DMAPT 的抗炎以及抗肿瘤的功能没有发生改变。研究发现，DMAPT 对人胰腺癌细胞具有很好的抑制作用9。因此，经过化学修饰的小白菊内酯DMAPT 可以作为一种治疗炎症和癌症的口服用药。Scheme 5其它位点结构修饰：2012年Chen Yue 组34以小白菊内酯为原料,在BF3-OE

21、t2、toluene、RT;p-TSA、MeOH、RT；p-TSA、CH2Cl2、RT条件下进行反应，每步反应产率为13%、26%、90%。 Scheme 6生物修饰：2013年，Rudi Fasan组35以小白菊内酯为原料，分别在在0.26mol%的P450 XII-F12、0.32mol%的P450 VII-H11两种酶的作用下，反应条件控制为NADPH， pH8.0，随后再分别加入R1COCl、R2COCl,同时加入TEA、DMAP、CH2Cl2，衍生物的生物活性较好,LD50值分别为2.3M、2.5M（LD50值是指能杀死一半试验总体之有害物质、有毒物质或游离辐射的剂量）。Scheme

22、 7小白菊内酯传统上主要用来治疗偏头痛、发热和类风湿性关节炎等17。近年来研究发现小白菊内酯在多种肿瘤中发挥抗癌作用，如乳腺癌、胆管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、黑色素瘤和神经元等，并成为研究的一个重要热点。许多研究发现小白菊内酯发挥抗肿瘤作用主要通过靶向作用于核转录因子-B ( NF-B)18，产生活性氧(ROS)19和活化 c-Jun 氨基端激酶(JNK)20等。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，成为目前治疗失败的重要原因，Gao 等21研究发现小白菊内酯可以增强发生耐药的肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，并且 Zuch 等22研究发现小白菊内酯可以增加肿瘤细胞对放疗的敏感性。这些结果使得小

23、白菊内酯有望成为一种新的抗肿瘤药物。本文就小白菊内酯在抗肿瘤作用进行研究，以期进一步推动小白菊内酯在抗肿瘤作用中的研究和应用。 小白菊内酯在促进癌细胞凋亡和减少癌细胞转移方面具有特殊的生物活性。最近研究发现23，在移植有人乳腺癌细胞的动物模型中，经过小白菊内酯喂养的动物能够显著地提高动物的存活率并能延长存活时间。该化合物能够与 NF-B、JNK 等信号通路中蛋白因子相互作用，同时诱导细胞内ROS的产生来抑制肿瘤细胞的生长。周惠琼等27在软骨细胞体外实验中发现 , PL可以调节软骨细胞蛋白聚糖的合成功能。表 2 小白菊内酯及其衍生物具有众多的药理活性化 合 物 名 称生 物 活 性参 考 文 献

24、小白菊内酯(PL)抗肿瘤活性人乳腺癌细胞, 肺、肠腺癌细胞23,28抗炎活性 炎性大鼠模型26,29抗肿瘤活性 肾癌细胞株26,30细胞毒活性 前列腺肿瘤干细胞24,31抗病毒活性 丙型肝炎病毒HCV 24,31二甲氨基-小白菊内酯(DMAPT)抗肿瘤活性 胰腺癌细胞 25,31细胞毒活性 急性髓细胞样白血病干细胞 25,311.3 Heck反应的介绍Mizoroki 和Heck 分别于1971 和1972 年发现了Heck 反应,Heck 反应是一类重要的形成与不饱和双键相连的新CC 键的反应,在过去30多年中已经逐渐发展成为一种应用日益广泛的有机合成方法。Heck反应,也称Mizoroki

25、Heck反应(scheme 8)，是不饱和卤代烃与烯烃,在强碱和钯催化下发生的偶联反应3233。理查德赫克、根岸英一和铃木章于2010年凭借此反应获得诺贝尔化学奖。Scheme 8 反应物主要为卤代芳烃(碘、溴、氟)与含有-吸电子基团的烯烃反应,生成芳香代烯烃，该反应的催化剂通常用Pd(0), Pd(II)或含Pd 配合物。原料卤代烃中的R基可以是芳基、苄基或乙烯基。烯烃的双键碳必须连有氢，且烯烃通常是缺电子烯烃。钯催化剂可以是四(三苯基膦)合钯、氯化钯或乙酸钯。强碱一般用三乙胺、碳酸钾或乙酸钠。 亲电性不饱和碳(sp 或sp2 杂化)与亲核性碳、氮、氧、硫、硒原子经过某些过渡金属的催化可以直

26、接成键, 这种交叉偶联反应是现代有机合成中重要的手段之一, 它使得我们能够高效地合成一系列芳基烯烃、炔烃化合物, 因而在染料、医药、天然产物、农药、肉桂酸型香料等日用化学品以及新型高分子材料的制备方面有着重要的应用价值。Heck反应的催化循环是围绕催化的钯中心而展开（scheme 9）。循环中所需的活性钯一般是由钯前体在反应中原位产生32，循环中，首先是电子不饱和的含钯化合物(1)与化合物卤代烃加成，钯插入到卤-碳键中。然后，钯原子与烯烃作用产生配合物(3)，配位的烯烃再顺式插入到钯-碳键中，得化合物(4)。化合物(4)经旋转异构化为扭张力较小的反式异构体后，发生-氢消除，获得另一个钯与烯烃配

27、位的中间体(5)。化合物(5)经解配，即得反应产物烯烃，同时还产生钯含化合物(6),而(6)在碱作用下发生还原消除，又转化为(1)，从而获得再生。Scheme 91.4立题依据目前，新型抗肿瘤药物的研究与开发是医学、药学、化学等学科的热点课题。1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和小白菊内酯是一类非常重要的含有,-不饱和内酯环外双键结构的倍半萜内酯，是有机合成的先导骨架和母体，由它们衍生的化合物往往具有选择性好、活性高等优点，在医药开发和新型医药制剂研究中起着重要的作用。随着科技迅速发展以及人们生活水平的提高，倍半萜内酯的研究与应用将会日益广泛。1-O-乙酰基大花旋覆花内酯结构改造仅有6-位羟基的修饰

28、，而对其它活性位点的修饰和作为药用成分的作用机制及构效关系研究尚不多见。所以对1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和小白菊内酯的其它位点进行结构修饰和衍生物的生物活性检测值得研究。1.5研究目的及意义由于1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和小白菊内酯具有多种药理活性，随着其药理学和分子生物学作用机制的研究开展不断深入，为1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和小白菊内酯及其衍生物的设计提供了明确的生物靶标，相信通过对1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和小白菊内酯结构官能团的修饰和改造，借助细胞和分子水平的筛选技术，能够对该活性化合物有进一步了解，并在此基础上获得活性更好的新型化合物，最终实现减少其毒副作用，提高生物活性和选

29、择性的目的，进而促进1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和小白菊内酯及其衍生物的研究与开发。 本文以苯甲酰氯、2-氟-苯甲酰氯、3-氟-苯甲酰氯、4-氟-苯甲酰氯、乙酰氯、碘苯、4-氟碘苯、4-溴碘苯、4-碘苯甲醚、3,4,5-三甲氧基碘苯等碘代物分别与ABL、OABL和PL进行反应，得到十五个化合物，随后通过1H NMR、13C NMR、ESI-MS等波谱学方法确定衍生物的化学结构，并对部分衍生物进行了细胞毒活性研究，期望能够筛选出具有更好生物活性的衍生物。第二章 实验部分2.1实验仪器LCQ FLEET 质谱仪 美国Thermo 公司DRX-500MHz 核磁共振仪 德国Bruker 公司DZX-

30、316020B 真空干燥箱 上海福玛实验设备有限公司Bchi R-200 型旋转薄膜蒸发仪 瑞士Buchi(布奇)公司ZF-6 型三用紫外线分析仪 上海嘉鹏科技有限公司SHB-循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司电子天平AUY 220（万分之一） 上海思龙科学仪器有限公司78 HW-1 恒温加热磁力搅拌器 杭州仪表电机有限公司2.2实验材料卤代烃选用的是苯甲酰氯、2-氟-苯甲酰氯、3-氟-苯甲酰氯、4-氟-苯甲酰氯、乙酰氯、碘苯、4-氟碘苯、4-溴碘苯、4-碘苯甲醚、3,4,5-三甲氧基碘苯；钯催化剂选用四三苯基磷钯；强碱选用三乙胺以及干燥处理过的N-N-二甲基甲酰胺；工业重蒸后的石油醚

31、、甲醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、分析纯的丙酮、二氯甲烷、碳酸钾、氢氧化钠等；水为蒸馏水。显色剂：磷钼酸显色剂。2.3 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯和1，6-O，O-乙酰基大花旋覆花内酯的结构修饰2.3.1 1-O-乙酰基大花旋覆花内酯6-OH的酯化修饰实验步骤：向干燥的吡啶中加入ABL(30.8mg,1eq.)，在0 oC及无水条件下加入溶于CH2Cl2的ArCOCl(17.4L,1.5eq.)，反应混合物在25 oC下搅拌30min,反应完全后，向溶剂中加入冰水，搅拌20min后，用二氯甲烷(5毫升3)萃取，去除溶剂后，产物可通过硅胶柱色谱纯化(石油醚：乙酸乙酯=5:1-1:1)，产率为

32、87%-99%。2.3.2 1，6-O，O-乙酰基大花旋覆花内酯13位环外双键的Heck偶联实验步骤：向干燥的N-N-二甲基甲酰胺(46.3L, 6eq.)中加入OABL(35mg, 1eq.)，随后加入三乙胺（41.3L，3eq.）,碘代苯（40.8mg, 2eq.）,最后加入四三苯基磷钯(1.12mg, 0.05eq.), 在氮气保护及油浴80 oC条件下，搅拌24-40 h后,反应混合物在室温下冷却,随后加5mL水淬灭，混合物用二氯甲烷(5毫升3)萃取，产物由硅胶柱层析进行纯化(石油醚：乙酸乙酯=5:1-1:1)，产率41%-82%。2.3.3 小白菊内酯13位环外双键的Heck偶联实验

33、步骤：向干燥的N-N-二甲基甲酰胺(37.3L, 6eq.)中加入小白菊内酯(20mg, 1eq.)，碘代苯（32.8mg, 2eq.）, 随后加入三乙胺（33.3L，3eq.）,最后加入四三苯基磷钯(0.90mg, 0.05eq.), 在氮气保护及油浴80 oC条件下，搅拌24-40 h后,反应混合物在室温下冷却,随后加5mL水淬灭，混合物用二氯甲烷(5毫升3)萃取，产物由硅胶柱层析进行纯化(石油醚：乙酸乙酯=5:1-1:1)，产率为57%-81%。 2.4实验结果与讨论 通过实验可以看出：对1-O-乙酰基大花旋覆花内酯来说，当卤代物为酰氯时，反应的产率较高，可达87%以上；对1，6-O，O

34、-乙酰基大花旋覆花内酯和小白菊内酯来说，当卤代物为碘代物时，反应的产率有所下降，最低为41%，说明羟基与酰氯比较容易反应，而端基烯烃与卤代苯的Heck偶联反应主要用钯作为催化剂，钯容易与磷配体形成催化活性中间体，催化C-C键的偶联反应，但反应时间较长，产率较低。化合物的结构鉴定：根据得到的1H NMR、13C NMR、ESI-MS等相关波谱数据，可以确定所得到的化合物均为预期要合成的化合物。 此处以GJ-6为例进行解析：根据得到的13C NMR(400 MHz, CDCl3)谱可以看出，共有25个碳信号，结合18.3 (C-15)、 20.2 (C-14)、21.0 (CH3CO-6)、21.

35、3 (CH3CO-1)说明该结构中可能含有4个甲基；根据26.6 (C-2)、30.6 (C-3)、33.2 (C-4)、35.2 (C-9)、42.7 (C-7)、64.2 (C-1)、64.7 (C-6)、74.7 (C-8)说明该结构中可能含有亚甲基、次甲基；根据64.2 (C-1)、64.7 (C-6)、74.7 (C-8) 三个碳原子的化学位移高于普通的亚甲基、次甲基，说明在三个碳原子可能与吸电子的氧原子相连，由于氧原子的吸电子效应，导致其化学位移向低波数方向移动；根据124.0 (C-11)、132.7 (C-5)、139.9 (C-13)、133.2 (C-10)说明该结构中可能

36、含有sp2杂化的碳原子，即可能含有双键；根据129.0 (2C, Ar-13), 130.6 (Ar-13), 130.9 (2C, Ar-13), 133.9 (Ar-13)说明该结构中可能含有苯环，由于苯环上的碳原子化学位移的对称性推断苯环为单取代；根据170.2 (C-12), 171.2 (CH3CO-6), 171.5 (CH3CO-1)说明该结构中含有羰基;另外从1H NMR(400 MHz, CDCl3)谱可以看出：0.67 - 0.79 (m, 4H, H-15, H-3b), 0.88 - 1.01 (m, 1H, H-3a), 1.22 - 1.44 (m, 2H, H-2

37、)说明2、3号位左右碳原子上均有氢原子，15号位的氢原子与3b氢原子发生J2偶合；根据1.80 (s, 3H, H-14), 2.03 (s, 3H, AcO-6), 2.06 (s, 3H, AcO-1)均出单峰，说明其含有3个甲基；根据2.55 - 2.64 (m, 1H, H-4)出多峰，而且含有1个H,说明4号位为次甲基；根据2.52 (dd, J = 15.8, 2.7 Hz, 1H, H-9b)、2.86 (dd, J = 15.8, 2.7 Hz, 1H, H-9a)即9号位的两个H原子发生自身耦合裂分,说明9号位连接的是亚甲基；根据3.80 - 3.88 (m, 1H, H-1

38、a), 3.89 - 3.98 (m, 1H, H-1b) 即1号位的两个H原子发生自身耦合裂分且与2号位碳原子上的氢原子发生耦合出多重峰,说明1号位连接的是亚甲基, 而且与吸电子的氧原子相连，由于氧原子的吸电子效应，导致其化学位移向低波数方向移动；根据4.08 (dt, J = 7.8, 2.3 Hz, 1H, H-7)、5.02 - 5.11 (m, 1H, H-8)、5.57 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H-6)、7.60 (d, J = 2.6 Hz, 1H, H-13) 说明6、7、8、13号位连接的是次甲基；根据7.40 - 7.55 (m, 3H, Ar-13), 7

39、.78 (d, J = 7.2 Hz, 2H, Ar-13)说明该结构中含有苯环，而且苯环是单取代；根据NOESY谱可知：H-6、H-7都与H-21有相关，说明13位双键处于E式。然后结合ESI-MS: 426.8 M+H+; HR-ESI-MS: calcd for C25H30NaO6 M+Na+: 449.1935; found: 449.1942, error = 1.6 ppm; HPLC: tR = 6.480 min, purity = 98% at ELSD，可知该化合物的分子量为426，分子式为C25H30O6与结果吻合。从而推出GJ-6的结构如下：实验过程中我们还幸运地得到

40、了GJ-9的单晶，通过X-ray图可以清楚地看到其环外双键处于E式，GJ-9的结构式及单晶衍射谱图如下：GJ-6的13C NMR、1H NMR 、NOESY、HR-ESI-MS 、HPLC图谱如下所示：13C NMR (100 MHz, CDCl3)1H NMR (400MHz, CDCl3)NOESYHR-ESI-MSHPLC purityHPLC purity determination: MeOH:H2O 80:20-100:0 10min98%, tR=6.48min ELSD2.5衍生物的细胞毒活性评价选取三株癌细胞HCT116（人结肠癌细胞）、HeLa（人宫颈癌细胞）、SGC-79

41、01（人胃癌细胞）作为衍生物的细胞毒活性评价对象，在铺有细胞的96孔板中加入不同浓度 的衍生物GJ-110和母体对照ABL以及阳性对照Vp-16（依托泊苷）,处理72 h后通过SRB方法测定IC50值（IC50代表凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应抑制剂的浓度），数据如表3所示。表 3 衍生物的细胞毒活性评价No.RIC50 (M)HCT116HeLaSGC-791GJ-1H10.5 2.15.19 0.99.930.06GJ-22-F21.1 2.417.0 0.919.3 1.5GJ-33-F14.5 2.311.8 1.112.9 3.1GJ-44-F14.9 2.012.0 1

42、.913.6 2.5GJ-5-10.1 1.111.2 0.815.9 2.1GJ-6H59.1 2.392.1 2.5-GJ-74-F10073.5 6.1-GJ-84-Br70.2 5.345.5 4.9-GJ-94-OMe10077.1 7.0-GJ-103,4,5-triOMe10090.9 1.6-ABL-36.1 3.132.6 2.5-Vp-16-70.256.560.68注三 注：IC50值：(平均数标准偏差)，由三组平行实验数据来确定。根据活性数据可知：经6-OH结构修饰的衍生物中GJ-1对不同肿瘤细胞的IC50值均较低，活性最好；经13-位环外双键结构

43、修饰后衍生物中GJ-8对不同肿瘤细胞的IC50值均较低，活性最好。GJ-15的细胞毒活性比母体ABL高，GJ-610的细胞毒活性比母体OABL低,揭示了6-OH不是此类倍半萜内酯的活性基团，13-位环外双键是此类倍半萜内酯的活性基团。第三章 探索部分3 .1探索带有杂环的碘代物与1-O-乙酰基大花旋覆花内酯进行反应的条件实验设计与合成路线如下：向干燥的N-N-二甲基甲酰胺(46.3L, 6eq.)中加入ABL(30.8mg, 1eq.)，随后加入三乙胺（41.7L，3eq.）,2-碘吡啶（21.3L, 2eq.）,最后加入四三苯基磷钯(1.12mg, 0.05eq.),在氮气保护及油浴80 o

44、C条件下，搅拌4-6h后,检测未发生反应，继续反应至20-24h再次检测仍未反应;随后将油浴温度升至100，继续反应4h，检测仍未反应;然后又向反应体系中加入0.05eq.的醋酸钯催化剂，继续反应4h, 检测仍未反应;随后改变溶剂、催化剂的用量以及其它带有杂环的碘代物如3-碘吡啶、2-碘噻吩、3-碘噻吩、2-碘呋喃、3-碘呋喃探索该反应。3 .2探索带有杂环的碘代物与小白菊内酯进行反应的条件实验设计与合成路线如下：向干燥的N-N-二甲基甲酰胺(46.3L, 6eq.)中加入PL(24.8mg, 1eq.)，随后加入三乙胺（41.7L，3eq.）,2-碘噻吩（22.1L, 2eq.）,最后加入四

45、三苯基磷钯(1.12mg, 0.05eq.),在氮气保护及油浴80 oC条件下，搅拌4-6h后,检测未发生反应，继续反应至20-24h再次检测仍未反应;随后将油浴温度升至100，继续反应4h，检测仍未反应;然后又向反应体系中加入0.05eq.的醋酸钯催化剂，继续反应4h, 检测仍未反应;随后改变溶剂、催化剂的用量以及其它带有杂环的碘代物如2-碘吡啶、3-碘吡啶、3-碘噻吩、2-碘呋喃、3-碘呋喃探索该反应。3 .3实验结果与讨论表 4探索部分的实验结果EntrySM1SM2SolventT()additional conditionsreaction11-O-乙酰基大花旋覆花内酯DMF80 -

46、NoDMF80100Acetone50-NoAcetone50802小白菊内酯Acetone80-NoAcetone80Cat DMSO80-NoDMSO80Cat 可能原因是：带有杂环的碘代物的杂原子与Pd形成络合物，导致催化剂Pd失活。第四章 结语与展望1-O-乙酰基大花旋覆花内酯是从中草药欧亚旋覆花中提取分离得到的一个天然产物，我国旋覆花资源丰富，分布广泛，研究不同种属旋覆花以及不同植物部位活性成分的分布，并对含量较高天然产物进行分离制备不仅有利于合理利用我国丰富的旋覆花资源，而且可促进这一天然产物的研究与开发。从国内外研究现状来看，1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的抗炎活性较为突出，有关其

47、抗炎作用机制的研究报道较多，而1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的细胞毒活性的研究报道并不是很多，其抗肿瘤作用的研究报道主要集中于1-O-乙酰基大花旋覆花内酯衍生物。由于1-O-乙酰基大花旋覆花内酯具有多种药理活性，随着其药理学和分子生物学作用机制的研究开展和不断深入，为1-O-乙酰基大花旋覆花内酯及其衍生物的设计提供了明确的生物靶标，相信通过对1-O-乙酰基大花旋覆花内酯结构官能团的修饰和改造，借助细胞和分子水平的筛选技术，能够对该活性化合物有进一步了解，并在此基础上获得活性更好的新型化合物，最终实现减少其毒副作用，达到提高生物活性和选择性的目的，进而促进1-O-乙酰基大花旋覆花内酯及其衍生物的研

48、究与开发。小白菊内酯的药理学研究主要集中在炎症、肿瘤和病毒感染等重大疾病方面，结果显示小白菊内酯可在微摩尔浓度下产生明显的药理活性，但作用机制至今尚未完全清楚，仍需进行更深入的研究。小白就内酯的低水溶性使其临床应用受到限制，已经合成的小白菊内酯氨基类似物及环化产物表现出了良好的水溶性及优越的药理活性。以小白菊内酯为先导化合物研发新药，对肿瘤、白血病等严重威胁人类生命健康且迄今无法有效治愈的疾病的预防和治疗具有重要的现实意义，对小白菊内酯及其来源植物的大力开发，将具有良好的社会经济效益。本文以1-O-乙酰基大花旋覆花内酯、小白菊内酯为原料，通过酯化和Heck偶联反应得到一些衍生物，根据得到的1H

49、 NMR、13C NMR、ESI-MS等相关波谱数据，确定了这些衍生物的化学结构。随后对部分衍生物进行细胞毒活性的研究，通过IC50值可以看出，对1-O-乙酰基大花旋覆花内酯6位羟基进行酯化修饰产物中含有苯基、甲基时衍生物的活性较好；对1，6-O，O-乙酰基大花旋覆花内酯13位环外双键进行Heck偶联反应衍生物的活性均较弱。目前对1-O-乙酰基大花旋覆花内酯的6位羟基进行酯化修饰的衍生物的抗肿瘤活性的详细作用机制以及是否有细胞选择性未发现相关研究报道，因此值得进一步研究。参考文献1国家药典委员会. 中华人民共和国药典.北京：化学工业出版社，2010：530.2Rankin, J.A.; Rey

50、nolds, H.Y. Histamine levels in bronchoalveolar lavage frompatients with astma, sarcoidosis, and idiopathic pulmonary fibrosis. J. Allergy. Clin. Immunol.1987, 79, 371377.3Zhang, L. Oral Chinese medicinal composition for treating asthma, and its preparation method (in Chinese). Faming Zhuanli Shenqi

51、ng Gongkai Shuomingshu 2007, 14.4Das, M.; Ram, A.; Ghosh, B. Luteolin alleviates bronchoconstriction and airway hyperreactivityin ovalbumin sensitized mice. Inflamm. Res. 2003, 52, 101106.5Park, H.; Lee, C.; Jung, I.; Lee, J.; Jeong, Y.; Chang, J.; Chun, S.; Kim, M.; Choi, I.; Ahn, S.;Shin, Y.; Yeom

52、, S.; Park, Y. Quercetin regulates Th1/Th2 balance in a murine model of asthma.Inter. Immunopharm. 2009, 3, 261267.6Je, K.H.; Han, A.; Lee, H.T.; Mar, W.; Seo, E.K. The inhibitory principle of lipopolysaccharideinduced nitric oxide production from Inula britannica var. chinensis. Arch. Pharm. Res. 2

53、004, 27,8385.7 吴一兵. 欧亚旋覆花化学成分的分离及主要活性成分1-O-乙酰基大花旋覆花内酯衍生物的合成D. 河北: 河北医科大学, 2006.8 程永浩, 刘守信, 白乃生. 单乙酰大花旋覆花内酯衍生物研究J. 应用化学, 2000, 17: 550- 552.9 Liu S X, L iu H, Yan W Y, et al. Studies on 1-O-acety lbr-itann ilactone and its derivative, (2-O-buty lox im e-3-phenyl)-prop iony-l 1-O- acetylbritann ilacto

54、ne ester J . B ioorg Med Chem Lett, 2004, 14( 5): 1101- 1104.10王红刚，王文桥，韩秀英，马志强，张小风. 旋覆花中1-氧-乙酰大花旋覆花内酯的分离分析及抑菌活性测定J.植物保护学报.2008,35(6):551-55611司亚茹,李珊珊,姜霞,王思明,李学慧,郑燕,史清文,董玫,张红真.3种倍半萜化合物抑制妇科肿瘤细胞增殖活性及其作用机制探讨J.癌变.畸变.突变.2010,22(1):28-31.12于峰，王思明，董玫，倪志宇，董富洁等. 三种倍半萜类化合物体外抗肿瘤细胞增殖活性研究J.天然产物研究与开发.2010,22:506-5

55、09.13丁海新，李广泽，冯俊涛等. 旋覆花杀菌活性成分的分离与鉴定.西北农林科技大学学报（自然科学版），2005, 33(3):90-94.14王俊杰.大花旋覆花内酯抑制HT-29结肠癌细胞株增殖及其机制研.石家庄：河北医科大学，2010.15Heptinstall S, Awang D, Dawson B, et al. Parthenolidecontent and bioactivity of feverfew ( Tanacetum parthenium )(L.Schultz 2 Bip. ). Estimation of commercial and authenticated feverfew productsJ. J Pharm Pharm acol, 1992, 44 (5) : 391 - 3