发酵工程大题

1、一、泡沫的形成及其对发酵的影响在大多数微生物发酵过程中，由于培养基中有蛋白类表面活性剂存在，在通气条件下，培养液中就形成了泡沫。泡沫是气体被分解在少量液体中的胶体体系，气液之间被一层液膜隔开，彼此不相连通。形成的泡沫有两种类型：一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫(fluidfoam)，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限。发酵过程产生少量的泡沫是正常的。泡沫的多少一方面与搅拌、通风有关；另一方面，与培养基性质有关。蛋白质原料如蛋白胨，玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要的发泡剂。糊精含量多也引起泡沫

2、的形成。发酵过程中，泡沫的形成有一定的规律性。发酵时起泡的方式被认为有五种：整个发酵过程中，泡沫保持恒定的水平；发酵早期，起泡后稳定地下降，以后保持恒定；发酵前期，泡沫稍微降低后又开始回升；发酵开始起泡能力低，以后上升；以上类型的综合方式。这些方式的出现是与基质的种类、通气搅拌强度和灭菌条件等因素有关，其中基质中的有机氮源(如黄豆饼粉等)是起泡的主要因素。当发酵感染杂菌和噬菌体时，泡沫异常多。起泡会带来许多不利因素，如发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小等。泡沫过多时，影响更为严重，造成大量逃液，发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会等，严重时通气搅拌也无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异

3、常或菌体自溶。所以，控制泡沫乃是保证正常发酵的基本条件。二、泡沫的消除泡沫的控制，可以采用两种途径：调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制，以减少泡沫形成的机会。但这些方法的效果有一定的限度；采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫。还可以采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素，如用杂交方法选出来不产生泡沫的土霉素生产菌株。对于已形成的泡沫，工业上可以采用机械消泡和化学消泡剂消泡或两者同时使用。 发酵工程一、名称解释1、前体 指某些化合物加入到发酵培养基

4、中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。（前体易氧化和挥发，一般采用流加的方法，有助于提高前体的转化率）2、发酵生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子3、菌浓度的测定 是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。4、搅拌热 ：在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热

5、与搅拌轴功率有关5、分批培养 ：简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。6、接种量 ： 移入种子的体积接种量 接种后培养液的体积7、比耗氧速度或呼吸强度 单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌-1h-18、次级代谢产物 是指微生物在一定生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质过程，这一过程的产物，即为次级代谢产物。9、实罐灭菌 实罐灭菌（即分批灭菌）将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持

6、一定时间，在冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，也叫间歇灭菌。（在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提 ）10、种子扩大培养 ：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。11、初级代谢产物 是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质和能量的过程。这一过程的产物即为初级代谢产物。12、倒种 ：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中13、

7、维持消耗（m） 指维持细胞最低活性所需消耗的能量，一般来讲，单位重量的细胞在单位时间内用于维持消耗所需的基质的量是一个常数。14、产物促进剂 是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。（可能是酶的诱导物、表面活性剂改善膜透性，传质提高，可能对酶的表面失活有保护作用、螯合有害金属离子）16、发酵热 ：所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温

8、度上升慢。17、染菌率 总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内19、临界溶氧浓度 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度20、回复突变 由突变型回到野生型的基因突变或者说高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能的下降的一种现象21、种子 用于发酵培养获得目的产品的的菌种，作为种子的准则：1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能够迅速生长，迟缓期短 2）生理性状稳定 3）菌种总量及浓度能够满足大容量发酵罐的要求 4）无杂菌污染 5）保持稳定的生产能力22、培养基 广义上讲培养基是指一切可

9、供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。23、发酵工程：利用微生物特定性状和功能，通过现代化学工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术集合并发展起来的发酵技术。24、富集 富集指使我们需要的目的菌种在数量上占据绝对的优势，几乎无其他杂菌，以便后续的筛选和培养。富集的三种方案：1）定向培养：采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养，如培养温度、pH、培养时间、底物抗生素之类等。2）当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑。3）不能提供任何有

10、助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法25、菌株选育、分子改造的目的：1）防止菌种退化 2）解决生产实际问题 3）提高生产能力 4）提高产品质量 5）开发新产品26、菌种选育的方法：1）基因突变：自然选育、诱变育种 2）基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程 3）基因直接进化： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能，如点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling27、负突变： 生产上不希望看到的表现为菌株的衰退和生产质量的下降28、正突变： 生产上希望看到的，对生产有利的30、结构类似物： 在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相

11、似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质31、合成培养基：原料其化学成分明确、稳定32、天然培养基：采用天然原料，具体成分不明确33、培养基分类：按成分：天然和合成培养基；按状态：固体、半固体和液体培养基；按作用：斜面（孢子）、种子和发酵培养基34、生理酸性物质：指那些经微生物生理作用后能形成酸性物质的物质，同理生理碱性物质指那些经微生物生理作用后能形成碱性物质的物质35、发酵指数： （发酵单位/发酵时间）*（发酵体积V/发酵罐体积V）36、热阻 ：微生物在某一特定条件下（主要指温度和加热方式）的致死时间。37、氧饱和度= 发酵液中的氧的浓度/

12、临界溶氧浓度（控制有氧发酵过程中氧饱和度1）38、细胞沉降体积： 指取10m l发酵液，让其自然沉降5h后的菌体体积V，value=(10-V）/10*100%39、氧载体 ：在发酵液中加入一种新的液相，以减少气液传氧阻力，从而提高传氧效率，这种液相一般具有比水更高的溶氧能力，且与发酵液互不相容，该液相就称为氧载体。40、分批培养 ：培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。最后一次性放罐。（优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易把握；缺点：产率低，不适于测定动力学数据）41、补料分批培

13、养 ：在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。（优点：低基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应，维持最佳生长和产物合成条件，自动化控制；缺点：比生产速率低，染菌机率增加）42、半连续培养 ：在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液。（优点：有害物质的放出利于产物合成；缺点：前体物质被稀释，提取总体积变大）43、连续培养 ： 发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制

14、性基质浓度都是恒定的。（优点：利于发酵最优化，发酵周期长，产量高，易于研究菌体生长的动力学；缺点：长期连续培养会引起菌种退化，降低产量，染菌机会增大）44、单因子实验 ：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验。45、在线检测参数 指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；离线检测参数 指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。46、CER 表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量47、OUR 表示单位体积发酵液单位时间内摄入的氧的量48、呼吸商RQ=CER/CUR49、液晶状态：指某些有机物在发生固相到液相转

15、变时的过渡状态称为液晶态。50、冷休克蛋白：低温微生物适应低温的一种方式，将菌体从高温转到低温环境是，细胞体内会诱导合成一组对低温的生理适应过程发挥着重要作用的蛋白，叫做冷休克蛋白。二、填空题1、 微生物发酵培养（过程）方法主要有 分批培养、补料分批培养、连续培养、半连续培养四种。2、 微生物生长一般可以分为：调整期、对数期、稳定期和衰亡期。3、 发酵过程工艺控制的只要化学参数 溶解氧、PH、核酸量等.4、 发酵过程控制的目的就是得到最大的比生产率和最大的得率。5、 菌种分离的一般过程 采样、富集、分离、目的菌的筛选。6、 富集培养目的就是让 目的菌 在种群中占优势，使筛选变得可能。7、 根据

16、工业微生物对氧气的需求不同，培养法可分为 好氧培养 和 厌氧培养 两种。8、 微生物的培养基根据生产用途只要分为 孢子 培养基、种子 培养基和发酵培养基。9、 常用灭菌方法：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌10、 常用工业微生物可分为： 细菌、 酵母菌、 霉菌、 放线菌四大类。11、 发酵过程工艺控制的代谢参数中物理参数 温度、压力、搅拌转速、功率输入、流加数率和质量 等12、 环境无菌的检测方法有：显微镜检查法、肉汤培养法、平板培养法、发酵过程的异常观察法等13、 染菌原因： 发酵工艺流程中的各环节漏洞和发酵过程管理不善两个方面。14、 实验室中进行的发酵菌液体发酵方式主要有四种：试管

17、液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养、台式发酵罐15、 发酵高产菌种选育方法包括 （自然选育）、（杂交育种）、（诱变育种）、（基因工程育种）、（原生质体融合）。16、 发酵产物整个分离提取路线可分为：预处理、固液分离、初步纯化、精细纯化和成品加工加工等五个主要过程。17、 发酵过程主要分析项目如下 ：pH、排气氧、排气CO2和呼吸熵、糖含量、氨基氮和氨氮、磷含量、菌浓度和菌形态。18、 微生物调节其代谢采用 酶活性、酶合成量、细胞膜的透性。19、 工业微生物菌种可以来自 自然分离，也可以来自从微生物 菌种保藏机构 单位获取。20、 发酵工业上常用的糖类主要有 葡萄糖、糖蜜。21、 工业发酵方式根据

18、所用菌种是单一或是多种可以分为 单一纯种 发酵和 混合 发酵。22、 种子及发酵液进行无菌状况控制常用的方法 显微镜检测法、酚红肉汤培养基法、平板画线培养法、发酵过程的异常观察法。23、 菌种的分离和筛选一般分为 采样、富集、分离、目的菌的筛选步骤。24、 常用灭菌方法有：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌25、发酵前期，在菌丝浓度低时，通气量低些，菌丝浓度高时再提高通气量。三、问答题补充问答题：1）如何发挥菌种最大的生产潜力？一、依据菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率二、依据菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等1、发酵工

19、程的概念是什么？发酵工程基本可分为那两个大部分，包括哪些内容?答：发酵工程是利用微生物特定性状好功能，通过现代化工程技术生产有用物质或其直接应用于工业化生产的技术体系，是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。也可以说是渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展，由于主要利用的是微生物发酵过程来生产产品，因此也称为微生物工程。 一.发酵部分: 1.菌种的特征和选育 2.培养基的特性，选择及其灭菌理论 3发酵液的特性 4.发酵机理。 5.发酵过程动力学 6.空气中悬浮细菌微粒的过滤机理 7.氧的传递。溶解。吸收。理论。 8.连续培养和连续发酵的

20、控制 二.提纯部分 1.细胞破碎，分离 2.液输送，过滤. 除杂 3.离子交换渗析，逆渗透，超滤 4.凝胶过滤，沉淀分离 5溶媒萃取，蒸发蒸馏结晶，干燥，包装等过程和单元操作2、现代发酵工程所用的发酵罐应具备那些特征？答：（1）、发酵罐应有适宜的径高比。罐身较长，氧的利用率较高；（2）、发酵罐应能承受一定的压力。因为发酵罐在灭菌和正常工作时，要承受一定的压力（气压和液压）和温度；（3）、发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，实现传质传热作用，保证微生物发酵过程中所需的溶解氧；（4）、发酵罐内应尽量减少死角，避免藏污纳垢，保证灭菌彻底，防止染菌；（5）、发酵罐应具有足够的冷却面积；（6）、搅拌器

21、的轴封要严密，以减少泄露。3、微生物发酵的种子应具备那几方面条件？答:（1）、菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短。（2）、生理性状稳定。（3）、菌体总量及浓度能满足大量发酵罐的要就。（4）、无杂菌污染。（5）、保持稳定的生产能力。4、发酵工业上常用的氮源有那些，起何作用？答：氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1、无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4NaNO3

22、 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响5、发酵和发酵产品生产的特点是什么，什么是种子扩大培养，其任务是什么？答： （1）发酵和其他化学工业的

23、最大区别在于它是生物体所进行的化（2）、种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。（3）、种子扩大培养的任务：现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。（1）发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下：1，发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。2

24、，发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。3，发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单的代谢产物。4，由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。5，发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产

25、上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。6，微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。7，工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，开可以取得显著的经济效益。基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌来进行反应；反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水

26、平在原有基础上有所提高和和创新。发酵产品的生产特点：一般操作条件比较温和；以淀粉、糖蜜等为主，辅以少量有机、无机氮源为原料；过程反应以生命体的自动调节方式进行；能合成复杂的化合物如酶、光学活性体等；能进行一些特殊反应，如官能团导入；生产产品的生物体本身也是产物，含有多种物质；生产过程中，需要防止杂菌污染；菌种性能被改变，从而获得新的反应性能或提高生产率。6、培养成分用量的确定有什么规律？答：（1）、参照微生物细胞内元素的比例确定。培养基的成分配比虽然千差万别，但都是用来培养某种微生物的，而不同类型的微生物细胞的成分比例其实是有一定规律的。这些规律可以在很大程度上知道培养基的基本成分配比的选择。

27、 不同种类的微生物内某种成分的含量其实是比较稳定的。培养基最终会被微生物吸收利用，因此其成分比例可以参考该种微生物的成分比例，至少可以作为一个重要依据。另外，尽管不同种类的微生物的成分比例有一定的差异，但还是有一定共性的。所以培养基中这集中营养成分不管由什么具体物质提供，其用量基本上也符合这种关系。（2）参照碳氮比确定。如果培养基中碳源过多，不利产物的合成。同样碳源过少或氮源过少对发酵的影响也是不利的。不同种微生物碳氮比差异很大，既是同种微生物在其不同生理时期对碳氮比要求也有不同，所以最适碳氮比要通过试验确定，一般在100：（120）之间。（3）、其他因素。培养基中一些用量极少的物质一般要严格

28、控制，不能过量。例如，维生素、微量元素、某些生长因子、前体等。具体用量要通过试验确定。培养基中的一些成分的比例会影响培养基的某些理化性质，这时要引起重视。 7、叙述防止发酵菌种退化的具体条件措施有那些？答：（1）控制传代次数：尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。（2）创造良好的培养条件：如在赤霉素生产菌G.fujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止衰退效果。（3）利用不易衰退的细胞传代：对于放线菌和霉菌，菌丝细胞常含有几个细胞核，因此用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核

29、的，用于接种就可避免这种现象。（4）采用有效的菌种保藏方法（5）合理的育种：选育菌种是所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞;合理选择诱变剂种类或增加突变位点，以减少分离回复突变；在诱变处理后及分离提纯化，从而保证保藏菌种的纯度。（6）、选用合适的培养基 在培养基中添加某种化学物质可以防止菌种退化。或者选取营养相对贫乏的培养基在菌种保藏培养基，限制菌株的生长代谢减少变异反而发生从而防止菌种的退化。8、如何选择最适发酵温度？答：1、根据菌种及生长阶段选择。微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使

30、菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。2、根据培养条件选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根

31、据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。9、不同时间染菌对发酵有什么影响，染菌如何控制？答：（1）种子培养期染菌：由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。（2）发酵前期染菌：发酵前期最易染菌，且危害最大。原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且

32、培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。（3）发酵中期染菌：发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4） 发酵后期染菌：发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。发

33、酵染菌后的措施：染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。l 凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。l 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒10、发酵级数确定的依据是什么？答：一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵青霉素：三级发酵一级种子 （小

34、罐）二级种子（中罐）发酵1、发酵级数确定的依据：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。2、级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。3、 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面11、发挥菌种的最大生产潜力主要考虑那几点？1菌种自身代谢特点：生长速率，呼吸强度，营养要求，代谢速率2菌种代谢与环境的关系：pH，渗透压，氧浓度等12、什么是半连续培养，说明其优缺点。答：在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点 代谢产

35、生的前体物被稀释，提取的总体积增大13、发酵工程主题微生物有什么特点？答：发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌特点：(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力(2)有极强的消化能力(3)有极强的繁殖能力14、什么叫染菌，对发酵有什么影响，对提炼有什么危害？答：染菌：发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖染菌的影响：发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。l 造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失l 扰乱生产秩序，破坏生产计划。l 遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。l 影响产品外观及内在质量发酵

36、染菌对提炼的影响：染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯15、结合所学微生物发酵工程课程论述某个工业发酵产品的生产工艺流程（可画图说明），越详细越好。答：培养基制备 、无菌空气制备、菌种与种子扩大培养 、发酵培养、通过化学工程技术分离、提取、精制。1 举出几例微生物大规模表达的产

37、品, 及其产生菌的特点？A. 蛋白酶表达产物一般分泌至胞外，能利用廉价的氮源，生长温度较高，生长速度快,纯化、分离及分析快速；安全性高，得到FDA的批准的菌种。B. 单细胞蛋白生长迅速，营养要求不高，易培养，能利用廉价的培养基或生产废物。适合大规模工业化生产，产量高，质量好。安全性高，得到FDA的批准的菌种。C. 不饱和脂肪酸生长温度较低，安全性高，能利用廉价的碳源，不饱和脂肪酸含量高，D. 抗生素生产性能稳定，产量高，不产色素，能利用廉价原料E 氨基酸：代谢途径清楚、简单2、 工业化菌种的要求？（积极性；安全性）利用廉价原料，简单培养基，大量合成产物产物合成途径简单，可操作性强遗传稳定不易染

38、菌、噬菌体菌种及合成产物无毒生产特性符合工艺要求3、 讨论：生产抗生素的微生物能不能生产氨基酸？不能，虽然微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有工业应用（大量表达等等）的潜力4、 讨论：微生物（包括动、植物）可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产，对于某一种特定的产品，为何只有特定的微生物才具有大量表达的潜力？答：工业化生产对于菌种有特定的要求，例如菌种产量高，合成途径简单，不易染菌无毒等等，因此对于某种特定的产品，只有某几种微生物才符合要求5、 自然界分离微生物的一般操作步骤？土样采取，预处理，培养

39、，菌落的选择，产品的鉴定6、 从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集？让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能7、 菌种选育分子改造的目的？防止菌种退化解决生产实际问题提高生产能力提高产品质量开发新产品9、 什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？在自然状态下，利用菌种的自然突变，从中选出所需的菌株意义：自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施10、 什么是正突变？什么是负突变？什么是结构类似物？负突变：生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降。正突变：生产上希望看到的，对生产有利。结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢

40、调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质11、 什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种物理：紫外，快中子； 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍12、 什么是基因的重组？什么是基因的直接进化？二者有何区别？基因的直接进化： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能基因的重组shuffling：DNA分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组。项目 进化速度 进化对象 进化周期 影响对象 突变效率常规定向进化 缓慢进化 整个基因组 多年 完整基因组 低基因重组 快速进化

41、 特定基因/操纵子/病毒 几天 部分基因组 高13、 什么是培养基?发酵培养基的特点和要求？培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件培养基作用：满足菌体生长，促进产物合成特点+要求：（规范化，规模化，标准化） 培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。14、 用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，

42、各自有何特点？糖类、油脂、有机酸、正烷烃葡糖糖所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应糖蜜制糖结晶母液，主要含量蔗糖50-75%，但含较多杂质，需预处理淀粉，糊精难利用（必须有水解淀粉糊精的酶），成分复杂；来源广，价格低，可解除葡萄糖效应15、 什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的（无机氮源）叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠16、 常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？无机氮源：氨盐、硝酸盐和氨水有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米

43、蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。有机氮源作用：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子17、 什么是前体？前体添加的方式？前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物合成到产物物分子中去，而其自身的结构(部分结构）并没有多大变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高方式：少量多次地流加18、 什么是生长因子？生长因子的来源？从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。来源：有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子19、 什么

44、是产物促进剂？产物促进剂举例？所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂举例：Tween（0.1%）大豆酒精提取物2%；植物质0.01-0.3%；洗净剂0.1%；苯乙醇20、 什么是理论转化率？什么是实际转化率？理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小21、 培养基设计的一般步骤？（1） 根据前人经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分（2） 通过单因子实验最终确定出最适宜的培养基成分（3） 当培养基成分确定后，剩下的问题就是个成分最适浓度，由于

45、成分很多，常采用一些合理的实验设计方法来减少试验次数。22、 培养基成分选择考虑的问题？菌体的同化能力 代谢的阻遏与诱导 合适的C，N比PH的要求24、讨论：培养基优化在发酵优化控制中的作用与地位优化分为两阶段：第一阶段控制菌体生长，使长好的菌体能处在最佳产物合成状态。培养基优化应保证菌体快速生长，有利于产物合成和分泌的酶系开启，不利于产物合成的酶系关闭，处于最佳的产物合成状态，并且副产物合成和分泌的酶系尽可能的少开启。第二阶段控制产物的合成。培养基优化应使产物合成能较长时间保持在最大合成速度。副产物的合成速率尽可能小。25、 什么是种子的扩大培养？种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中

46、处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子26、 种子扩大培养的目的与要求？目的：1） 接种量的需要2） 菌种的驯化3） 缩短发酵时间、保证生产水平要求1） 总量及浓度能满足要求2） 生理状况稳定3） 个体育菌体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长4） 无杂菌污染27、 种子扩大培养的一般步骤？休眠孢子，母斜面活化，摇瓶种子或茄子瓶斜面或固体培养基孢子，一级种子罐，二级种子罐，发酵罐28、 在大规模发酵的种子制备过程中，实验室阶段和生产车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点？实验室阶段：1培养物选择的原

47、则对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的孢子；对于菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体2、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。规模小，培养基较精细（保证质量）生产车间阶段：1、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。（优于孢子：缩短发酵时间/有利于获得好发酵结果）2 培养基选择的原则1）获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富；2）培养基不如实验室阶段精细，基本接近发酵培养基，这有两个方面的原因:

48、一是成本二是驯化29、 什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？移入种子的体积接种量 接种后培养液的体积细菌：5%;霉菌10%，放线菌20%30、 什么时发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？发酵级数：制备种子需逐级扩大培养的次数，一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。发酵级数对发酵影响：1.种子级数少，可简化工艺和控制，减少染菌机会2.种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会3.级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。影响发酵级数的因素：(1)菌种生长特性,孢子发芽及菌

49、体繁殖速度;(2) 发酵规模.（3）工艺要求.（4）接种量的影响.31、 什么是种龄？事宜种龄确定的依据？种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定33、 接种、倒种、双种？接种：接入种子罐后直接移种到发酵罐。双种：两个种子罐种子接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐34、 么是菌体的生长比速？产物的形成比速？基质的消耗比速？维持消耗？菌体的比生长速率：单位重量的菌体瞬时增量=（dx/dt）/x；单位为1/h，其中x菌体浓度（g/L ）产物的形成比速：单位时间内单位菌体形

50、成产物（菌体）的量=（dp/dt）/x,；单位为1/h，其中p产物浓度（g/L ）基质的比消耗速率:单位时间内单位菌体消耗基质的量=-（ds/dt）/x；单位为1/h，其中s底物浓度（g/L ）35、 什么是Monod方程其使用条件如何？各参数的意义与求解？当培养基中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的生长速率与基质浓度关系（Monod方程式）如下：=max S/（Ks+ S）：菌体的生长比速. S：限制性基质浓度. Ks：半饱和常数. max: 最大比生长速度Monod方程的参数求解(双倒数法)：将Monod方程取倒数可得：1/=1/max+ Ks/max S或S/= S/max+ Ks/ma

51、x这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数36、 什么是初级代谢产物？什么是次级代谢产物？初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质，如氨基酸、核苷酸次级代谢产物：对细胞的代谢功能没有明显的影响，一般在稳定期形成，如抗生素37、 什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？一类发酵：偶联，产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来,产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。在这些发酵过程中，菌体的生长、基质的消耗、产物的生成三个速度都有一个高峰，

52、三高峰几乎同时出现。二类发酵：部分偶联，产物形成与底物利用间接相关，为部分生长联系型，又称中间发酵型，产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体代谢的主流产物。它的特点是在发酵的第一时期碳源大量消耗用于菌体的迅速增长而产物的形成很少或全无，第二时期碳源大量消耗用于产物的高速合成及菌体的生长。三类发酵：非偶联，产物形成与底物利用不相关，为非生长联系型，又称复杂发酵型，产物的生成在菌体生长和基质消耗完以后才开始，与菌体生长不相关，与基质消耗无直接关系，所形成的产物为次级代谢产物。38、 什么是连续培养？什么是连续培养的稀释率？由于新鲜培养基不断补充，所以不会发生营养物的枯竭，另一方面，发酵液不断取出，发

53、酵罐内的微生物始终处于旺盛的指数生长期，罐内细胞浓度X、比生长速率、以及t, pH等都保持恒定。稀释率(D):补料速度与反应器体积的比值(h-1)39、 解释连续培养富集微生物的原理？菌的积累速率=生长速率-流出速率,调节培养基,使目的菌的流出速率生长速率,就起到富集作用40、 为何氧容易成为好氧发酵的限制性因素？氧是需氧微生物生长所必需的。氧往往容易成为控制因素，是因为氧在水中的溶解度很低，培养基因含有大量的有机和无机物质，氧的溶解度比水中还要更低。在对数生长期即使发酵液中的氧浓度达到饱和，若此时终止供氧，发酵液中的溶氧可在几分钟内全部耗尽，使溶氧成为控制因素41、 比耗氧速度和呼吸强度的感

54、念？比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌-1h-142、 临界饱和溶氧浓度、临界溶氧浓度、氧饱和度的概念？饱和溶氧浓度：在一定温度和压力下，空气中的氧在水中的溶解度。(mol/m3)临界氧浓度：CCr临界氧浓度：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。氧饱和度：发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度 一般发酵中控制大于143、 微生物的临界溶氧浓度一般多少，发酵过程中的氧容易不容易满足？0.0050.02mmol/L（氧饱和度1-15%），不容易满足，氧气在水中的溶解度而微生物尤其在对数期的呼吸强度很大44、 影响微生物需氧的因素有哪些？细胞浓度直接影响

55、培养液的摄氧率，在分批发酵中摄氧率变化很大，不同生长阶段需氧不同，对数生长后期达最大值。培养基的成分和浓度显著影响微生物的摄氧率，碳源种类对细胞的需氧量有很大影响，一般葡萄糖的利用速度比其他的糖要快。r=QO2*X ( 菌体浓度/遗传因素、菌龄，营养成分与浓度，有害物质的积累，培养条件)45、 发酵液中的体积氧传递方程？其中Kla的物理意义是什么？以单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a (m2/m3)OTR=KL (C* CL ）KL以氧浓度为推动力的容积氧传递系数，反映了设备的供氧能力（以C*-C 为推动力的体积溶氧浓度h-1）46、 如何调节摇瓶发酵的供氧水平？调节Kla，其反映了设

56、备的供养能力往复，频率80-120分/次，振幅 8cm旋转，偏心距转速250rpm装液量，一般取1/10左右：250ml 15-25 ml500ml 30 ml750ml 80 ml47、 如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好48、 如何测定发酵液中的溶氧浓度，以及发酵罐的Kla?一、CL的测定： 1、化学法；2、溶氧电极二、Kla的测定： 1、亚硫酸盐法（冷膜）；2、平衡法；3、动态法49、 氧的供需研究与反应器设计与放大的关系？发酵过程放大困难的原因就在放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败(供氧、混合、剪切）50、 发酵过程中溶氧浓度监控的意义？1） 考察工艺控制是否满足要求2） 其它异常情况的表征染菌、噬菌体、设备