产品内毒素检查

1、浙江*药业股份有限公司 SOP-QC-*内毒素标准操作规程1. 目 的：建立样品中细菌内毒素检查方法标准操作规程，规范操作。2. 适用范围：化验室3. 有关责任：化验室化验员对本规程的实施负责，化验室主任对本规程的有效执行承担监督检查责任。4. 程 序：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断样品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素的量用内毒素单位EU表示。4.1试验材料及工具4.1.1 分析天平4.1.2 电热干燥箱（250）4.1.3 恒温培养箱型号4.1.4 旋涡混合器4.1.5 微量移液器 2001000l 50200l4.1.6 无热源吸头 大号、小号、试管

2、架、封口膜4.1.7 鲎试剂 （应具有国家主管部门的批准文号，我公司常用湛江安度斯）4.1.8 细菌内毒素检查用水（BET水）4.1.9 细菌内毒素工作标准品4.1.10 无热源的小试管1075mm或无热源安瓿4.1.11 无热源的小试管15100mm及无热源的药匙4.2 操作方法4.2.1 实验准备将所有玻璃器皿及药匙用洗液（包括三效灭活剂）浸泡4小时以上，用清水及纯化水冲洗后，置250电热干燥箱中干热灭菌30分钟以上。试验过程中应防止微生物的污染。4.2.2供试品溶液制备精密称定样品20mg于无热源的15100mm小试管中，加混合液（280mg 96%乙醇溶液+650mg 聚氧乙烯蓖麻油）

3、2ml，置自动旋涡混合器中30秒使样品溶解后，再用BET水稀释成1mg/ml样品原液（C），置自动旋涡混合器中混和30秒。根据L值（限值），确定样品的最大有效稀释倍数（MVD）：MVD= c L / 式中： L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液浓度； 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml).例：L值为2EU/mg，鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。 2EU/mgC 2EU/mg1mg/mlMVD= = = 16倍 0.125EU/ml吸取样品原液（浓度为1mg/ml）按如下表1稀释制得供试品溶液：表1L值MVD原液体积加BET水量（=总体积吸原液体积）供试品溶液总体积2 E

4、U/g160.1 ml1.5 ml1.6 ml4.2.2 内毒素工作标准溶液的制备根据鲎试剂灵敏度的标示值，取细菌内毒素工作标准品一支，加入1ml BET水，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟，然后制成所需浓度的细菌内毒素标准溶液（2）每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。例：细菌内毒素工作标准品为50EU/支，加BET水1ml即50EU/ml，如鲎试剂灵敏度为0.125，那么细菌内毒素标准溶液应当为20.125=0.25 即0.25EU/ml。应按以下方式进行稀释： 0.3ml 0.5ml 1ml 1ml 1ml50EU/ml 5EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.

5、25EU/ml 0.125EU/ml2.7ml 2.0ml 1ml 1ml 1ml 4 2 4.2.4 凝胶限度试验在制备内毒素工作标准溶液的同时，取鲎试剂8支，按表2制备溶液A、B、C、D。编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数备注A无/供试品溶液2供试品溶液B2/供试品溶液2供试品溶液阳性对照C2/ BET水2阳性对照D无/ BET水2阴性对照A: 鲎试剂加0.1mlBET水复溶，再加入0.1ml供试品溶液，为供试品管； B: 鲎试剂加入0.1ml供试品溶液复溶，再加2内毒素标准溶液，为供试品阳性对照管，即（PPC管）；C: 鲎试剂加0.1mlBET水复溶，再加入0.1ml 内毒素标准溶

6、液，为阳性对照管；D: 鲎试剂加0.1mlBET水复溶，再加入0.1ml BET水，为阴性对照管。加样结束后，封口，放入371的恒温装置内保温602分钟后观察结果。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。结果判断：若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定（小于L值）。若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，

7、需进行复试。复试时溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。5. 鲎试剂灵敏度复核试验5.1实验准备 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用纯化水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放入250电热干燥箱干热灭菌30分钟以上。达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干热灭菌30分钟以上除去可能存

8、在的外源性内毒素。5.2鲎试剂灵敏度复核5.2.1细菌内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2、0.5、0.25（为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。5.2.2.待复核鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精

9、棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。5.2.3.加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2、0.5、和0.25的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。5.2.4.反应：加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入371水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温602分钟。5.2.5.观察并记录结果：将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180观察，

10、管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或形成凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）。5.2.6 判断依据：如最大浓度2,4管均为阳性，最低浓度0.25,4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（c）。c= antilg(X/4) 式中X - 反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。当c在0.52（包括0.5和2）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。5.3.

11、再试验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。5.4 注意事项：新购入鲎试剂，BET水，细菌内毒素工作对照品都需做鲎试剂灵敏度复核试验。6. 干扰试验6.1目的：通过比较鲎试剂在内毒素水溶液和内毒素供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对细菌内毒素检查有干扰。6.2. 试验程序6.2.1. 内毒素限值L值例：内毒素的限值L值为2EU/g。6.2.2. 选择：鲎试剂灵敏度 = 0.125 EU/ml6.2.3.确定供试品的最大有效稀释倍数 MVD=2/0.125=16 6.2.4.制备：6.2.4.1 鲎试剂标示灵敏度的对照

12、系列：2、0.5、0.25内毒素水溶液Es系列取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后稀释制成4个浓度的标准溶液即2、0.5、0.25，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。6.2.4.2 干扰试验系列：2、0.5、0.25内毒素供试品溶液Et系列（用供试品稀释液代替BET水对内毒素进行稀释）将供试品稀释初筛试验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液另取1支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2、0.5、0.25的含内毒素的供试品溶液。稀释方法同上。6.2.5 操作 取规格为0.1ml/支的鲎试剂30支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒

13、精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。l TAL+BET水（NC），平行2管将准备好的鲎试剂取其中2支（管）放在试管架上，排成1列，1列2支（管），每支分别加入0.1ml检查用水作为阴性对照；l TAL+Es系列，平行2管将准备好的鲎试剂取其中8支（管）放在试管架上，排成4列，每列2支（管），每支分别加入0.1ml的2、0.5、0.25的内毒素标准溶液，作为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；l TAL+供试品溶液（NPC），平行4管将准备好的鲎试剂取4支（管）鲎试剂放在试管架上，排成1列4支（管），每支（管）分别加入0.1ml供试品溶液作为供试品溶液；l TAL+Et系列，平行4管将准备好的鲎试剂另取16支（管）鲎试剂放在试管架上，排成4列，每列4支（管），每支分别加入0.1ml的含2、0.5、0.25的内毒素的供试品溶液，为干扰试验系列。反应：加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入371水浴或适宜恒温器中，保温602分钟后，观察并记录结果。6.2.7.结果判断：试验有效：NC管全部阴性（- -），NPC管全部阴性（- - - -）TAL+Es系列：2管全部阳性（+ + ），0.25管全部阴性（- -）TAL+Et系列：2管全部阳性（+ + + +），0.25管全部阴性（-