生物柴油合成中脂肪酶的应用研究

1、近些年，将植物油和动物脂肪通过酯化反应制备生物柴油的方法受到了人们越来越多的关注。在不同类型油料的脂交换反应中，用甘油三酸酯和醇（主要是甲醇和乙醇）反应来生产酯类和甘油。此反应常用的催化剂有酸、碱和脂肪酶。酸、碱在很短的反应时间内可催化甘油三酸酯转化成相应甲酯，且转化率较高。但此反应也有一些缺点：如甘油的回收等很困难，酸或碱催化剂必需从产品中去除，废水需要处理等。目前，人们的主要兴趣集中在利用脂肪酶将植物油或其它农业脂肪原料催化合成生物柴油。1生物柴油合成用脂肪酶的种类脂肪酶（酰基甘油水解酶，E.C.3.1.1.3）是一种广泛分布于动物、植物和微生物中的酶，能够进行可逆的甘油酯键水解，因此也能

2、够进行甘油酯合成。在一定的条件下，脂肪酶也能够催化许多酯化反应。无论在小规模的还是工业规模的酯合成中作为催化剂，脂肪酶已经得到成功应用。目前至少有35种可以利用的商业脂肪酶制剂，但仅有少数几种能在工业中使用（见表1）。固定化酶由于其自身的一此优越性，在生物柴油酶催化合成中越来越受到青睐。固定化酶的优点在于：催化效率高；酶的费用较低；酶不会进入产物中；提高了酶的稳定性；改善了酶的行为；可连续加工，因而能更好地控制产品质量；有利于多酶系统的利用。在脂肪酶的固定化方面，目前国内外的研究重点主要集中在固定载体的选择与固定条件的优化上。Orc等研究了来源于Burkholderia cepacia和Pse

3、udomonas cepacia的商业脂肪酶制剂，固定化于用CO2超临界技术干燥的石英纤维气凝胶中，催化向日葵油与乙酸甲酯合成生物柴油。气凝胶胶囊技术能够使酶在有机疏水介质中维持与在水溶液中相似的分散性，两种胶囊化的脂肪酶的活力相对比较接近，可与固定化于大孔丙烯酸树脂的Novozyme435相媲美。曾淑华等采用溶胶-凝胶法对脂肪酶进行了固定化，考察了固定化酶催化大豆油转酯化的生产工艺。Yagiz等研究了水滑石和4种不同类型的沸石作为固定化酶的材料情况。发现水滑石上吸附的蛋白质的量为13 mg/g，比沸石（9 mg/g）高，5 h后水滑石上酶的固定化可达到稳定状态。姜绍通等以高吸水树脂为载体，采

4、用物理吸附和戊二醛交联的方法固定化脂肪酶。研究结果表明，吸附法和交联法固定化酶与游离酶相比催化活性提高了2倍以上，且其pH稳定性、热稳定性均高于游离酶。TAN等在大孔树脂上吸附固定化脂肪酶，酯转化率可达到97.3%。在使用19次后依然达到70.2%。2生物柴油的胞外脂肪酶催化合成近些年来，人们对于酶在有机合成中应用的兴趣日益高涨。许多注意力都集中于在不同反应体系中脂肪酶的催化特性上。2.1有机溶剂体系中的催化合成目前已有很多关于脂肪酶在有机溶剂中的催化转酯反应研究。以正已烷为溶剂，Nelson等发现毛霉菌来源的脂肪酶用于将甘油三酸酯与低级醇作用转化成它们的烷酯是最有效的。通过使用几种不同的有机

5、溶剂，Hadzir等用Lipozyme和Novozyme催化甘油三酯和油醇生产蜡状脂的醇解反应。他们发现有机溶剂严重地影响着脂肪酶的活性，庚烷和正已烷被证实是最好的有机溶剂。Soumanou等研究了在正已烷的开放体系中几种植物油的脂肪酶催化醇解作用。他们发现Thermomyces lanuginose脂肪酶催化转化率最高（97%），相比之下，此酶在使用甲醇或2-丙醇为底物的无溶剂体系中几乎没有活性。通过在干燥的催化剂中混和使用碳水化合物、聚合体和有机缓冲剂，由于有机介质微环境的改善，可以在有机溶剂中提高酶的催化活性。Pu等研究了在已烷中盐固定化脂肪酶和它的酯交换反应，他们发现用EDTA-Na2

6、固定化的脂肪酶在已烷中的酯交换活性相比在其盐溶液中脂肪酶的活性提高了463%2700%。Li等研究了以叔丁醇为反应介质的新体系。当叔丁醇/油体积比1 1；甲醇/油摩尔比率4 1；3%Lipozyme TL IM和1%Novozym 435基于油重；温度35；130 r/min、12 h时，生物柴油和最高收率可达95%。研究还发现：以叔丁醇为反应介质脂肪酶重复使用200个周期而没有明显损失，脂肪酶表现出很好的稳定性。叔丁醇作为一个新的反应介质，其可有效减小由于过量的甲醇和副产物甘油引起的负面影响。2.2无溶剂体系中的催化合成许多类型的醇如伯醇、仲醇以及直链、链醇都可以用来在脂肪酶的催化下进行酯交

7、换反应。Nelson等研究了在与短链醇发生交换反应反应中脂肪酶的催化能力。在无溶剂反应体系中，与甲醇和乙醇反应的收率比有正已烷参与的收率要低一些；与甲醇的反应收率降低了19.4%。Mittelbach报道了在使用甲醇、乙醇和正丁醇时的情况。虽然与乙醇和正丁醇反应时，收率较高，但是与甲醇的反应中仅获得微量的甲酯。Abigor等也发现在棕榈油与乙醇反应可获得最高72%的交换率，而与甲醇反应仅得到15%的甲酯。所以说脂肪酶对长链脂肪醇比短链脂肪醇的催化作用更有效。总体上无论在有无溶剂的体系中，甘油三酸酯与甲醇的酯交换反应效率和与乙醇的反应效率相比要低得多。在实际工业应用中，在无溶剂体系中脂肪酶的催化

8、醇解作用十分重要，此体系的优点就是可以避免后分离、毒性和有机溶剂易燃等问题。2.3 AOT反胶束体系中的催化合成已有报道表明，对于脂肪酶催化反应，胶束界面面积的大小限制着反应速率。人们已认识到对于包含水不溶性底物的酶催化反应，反相胶束是一个很好的介质，这是因为它提供了一个相当可观的界面面积。许多不同类型的表面活性剂被用来组成反相胶束，最常用的表面活性剂是AOT琥珀酸双（2-乙基已基）脂磺酸钠。由于其紧密的结构和热力学稳定性，AOT表现异常好。Riter等报道了在AOT/水/异辛烷反相胶束中脂肪酶的活性受到水的负面影响。另外，一些报道表明如AOT这样的离子表面活性剂与溶解的酶分子间的静电和疏水作

9、用导致了酶活性的降低。为了提高AOT反相胶束中脂肪酶的活性和稳定性，人们采取了一些措施如AOT的化学修饰，脂肪酶的预处理和AOT反相胶束的修正。Moniruzzaman等在AOT/水/异辛烷体系中加入疏水质子溶剂，考察了其对Chromobacterium viscosum脂肪酶活性、稳定性及动力学的影响。在试验的7种疏水溶剂中，二甲基亚砜是最有效的。通过优化水、AOT的摩尔比率，缓冲液pH值和表面活性剂浓度等相关参数，可以提高脂肪酶活性且半衰期从33天提高到了125天。2.4离子液体中的催化合成近年来，离子液体作为一种性能优良的绿色溶剂受到越来越多的关注。离子液体可作为脂肪酶的载体进行酯交换反

10、应，这一概念是Klibanov及其同事提出的。紧随Klibanov之后，Lau等研究了以离子性流体(C4mimBF4或C4mimPF6)为反应介质中脂肪酶的催化醇解反应。在50，Lozano等对Candida antarctica脂肪酶B在4种不同含水量的离子流体中的活性和稳定性进行了研究，报道了所有的离子流体对于脂肪酶催化反应是适合的，都比在有机介质中要好。Ha等在23种离子流体中试验了生物柴油的Candida antarctica脂肪酶催化合成方法。其中在EmimTfO流体中50反应12 h后脂肪酸甲酯的收率为80%，为无溶剂体系中的8倍，比叔丁醇体系中高15%。此方法对于寻求在新的反应体

11、系中进行生物柴油的脂肪酶法催化合成不失为一种很好的思路。3生物柴油的甲醇分解合成3.1生物柴油的短链醇分解合成从生产成本和对生物柴油的技术要求来看，短链醇是最好的酰基受体，故人们对生物柴油的短链醇分解合成进行了研究。Salis等对线性和支链短链醇的影响进行了研究，最差的醇就要数甲醇和2-丁醇了，前者大概是由于其与油的互溶性较差后者是由于仲醇比伯醇反应惰性大。相反，具有短烷基链（C2C4）的直链和枝链伯醇表现出很高的反应速率与转化率。Abigor等报道了棕榈核油和椰子油与不同链长的醇在脂肪酶催化条件下的生产情况。在棕榈核油的转化过程中，没有任何反应混合物以外的溶剂，乙醇与之反应所得转化率最高为7

12、2%，其次为叔丁醇62%、丁醇42%、丙醇42%、异丙醇24%，而用甲醇时只得到了15%的甲酯转化率。De等研究了在无溶剂体系中使用固定化脂肪酶（Lipozyme IM-20）进行醇酯的交换反应。他们发现随着醇链的增长所得酯的熔点也在不断稳步增长，但对于相同链长的醇，随着其不饱和度增加反而降低。如以上诠释的那样，酶的催化醇解在有机无溶剂体系中长链醇和分支醇往往处于优势地位，但是在有机无溶剂体系中甲醇醇解却没有一个较高的转化率。基于此，如何能得到一个高的转化率，这对人们利用脂肪酸与甲醇反应制备生物柴油来说是十分重要的。3.2生物柴油的甲醇分解合成虽然说甲醇分解合成作用在生物柴油的催化合成中不占有

13、优势，但由于其价廉易得，在脂肪酯类中碳链最短，故受到了人们的青睐。Du等研究了在大豆油与甲醇的酶催化酯交换反应生产生物柴油。由于lipozyme TL具有严格的1，3-位特异性，生物柴油的收率仅为66%，然而事实上其收率超过了90%，后来证实在反应过程中发生了酰基转移作用。油脂和甲醇的混合液中，酶会失活，Samukawa等研究了当Novozym 435在油酸甲酯中活化0.5h后，再在大豆油中活化12 h，甲醇分解反应速度得到很大的提高。结果在3.5 h内每间隔0.250.4 h分步添0.33 mol的甲醇，反应混合物中甲酯的含量可超过97%。Shimada等开发了一种分步添加甲醇的方法来避免脂

14、肪酶失活，结果在50个反应周期后，酯交换率超过了95%。使用上述相同的酶，Watanabe等开发用三步甲醇法从植物油连续生产甲酯的方法，洗出液中甲酯的含量达到了93%，且固定化脂肪酶可使用100天而酶活没有任何降低。Lee等通过三步反应，使猪油和餐馆油脂来源的动物油脂有一个相对高的转化率，然而，在连续分批操作中当甲醇和油的摩尔比大于2 1时脂肪酶的活性急剧损失，此时最适温度为3040。4生物柴油的胞内脂肪酶催化合成生物转化可以通过使用胞外和胞内脂肪酶来进行，但是胞外酶需要纯化，这对于实际应用来说过于复杂。而且酶的回收过程既不稳定又很昂贵，促使人们考虑使用整个细胞来作为催化剂。为了更好地利用整个

15、细胞催化剂，细胞应该以传统固相催化剂的形式来进行固定化。在多种可供利用的固定化方法中，Atkinson等开发了一种使用多孔生物载体粒子（biomass support particles，BSPs）的技术，由于其诸多优点，已被广泛应用于微生物、动物、昆虫和植物细胞体系。将Rhizopas Oryzae细胞作为整个生物催化剂固定在BSPs中，Hama等将Rhizopus oryzae细胞固定在6 mm6 mm3 mm立方体的聚氨酯泡沫体BSPs中，在一个20 L的填充床生物反应器中进行间歇培养。流速为25 L/h时在第一个生产周期甲酯含量超过90%，第10个周期后可以达到80%。Ban等的研究表

16、明当含水量为10%20%，用BSPs固定Rhizopas.oryzae细胞，没有任何有机溶剂预处理的情况下，反应混合物中甲酯的含量达到了80%90%，此甲酯的生产水平几乎和使用胞外脂肪酶时是一致的。为了稳定Rhizopas.Oryzae细胞，对其用0.1%的戊二醛溶液进行十字交联处理，细胞中脂肪酶的活性在6个培养周期期间没有大的下降，甲酯的含量在72 h内达到70%83%。这些发现表明固定整个细胞生物催化剂的生物载体粒子的使用给生物柴油燃料的工业化生产提供了一条光明的途径。6结语生物柴油就是以动植物油脂为原料制造的可再生能源，即脂肪酸甲酯，可作为石油柴油的替代燃料。生物柴油的发展不仅有利于解决能源问题，而且可以减少温室气体的排放量，这些都是吸引发展生物柴油的主要原因。酶法合成生物柴油的优点是其反应条件温和、醇用量小、产品易于收集以及无污染排放等。目前存在的问题主要有：对甲醇及乙醇的转化率低，一般仅为40%60%；短链醇对酶有一定毒性，使得酶的使用寿命短；副产物甘