黄酮类成分分析

1、2 2 黄酮黄酮类成分分析类成分分析 一、结构特征及理化性质一、结构特征及理化性质v结构特征结构特征 基本母核：2-苯基色原酮（C6-C3-C6）v理化性质理化性质物理性状物理性状结晶性固体或无定形粉末。大多数呈黄色，其颜色的有无与交叉共轭体系有关。如：黄酮、黄酮醇及其苷类多呈黄色；二氢黄酮、二氢黄酮醇及黄烷醇呈无色；异黄酮呈无色或微黄色。溶解性溶解性游离苷元易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶及稀碱水黄酮苷易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂OO酸碱性酸碱性酸性：与酚羟基的数目和位置有关 7,4- 二羟基 7或4- 羟基 一般酚羟基 5-羟基碱性：r-吡喃酮环上的1-位氧原子，可表现出微弱碱

2、性显色反应显色反应 还原反应（盐酸镁粉反应） 与金属盐类试剂的配合反应（铝、铅、锆、镁盐） 硼酸显色反应碱性试剂反应 五氯化锑反应 Gibbs反应和Emerson反应光谱特征光谱特征 I带(300-400nm) B环桂皮酰基 II带(240-285nm) A环苯甲酰基 二、鉴别二、鉴别v化学反应法化学反应法还原反应还原反应盐酸镁粉反应 鉴定黄酮类常规反应钠汞齐还原反应四氢硼钠还原反应 专属性较高 专门鉴别二氢黄酮、二氢黄酮醇与其它黄酮类区别与金属盐类试剂的配合反应（铝、铅、锆、镁盐）与金属盐类试剂的配合反应（铝、铅、锆、镁盐）三氯化铝反应 鉴别邻二酚羟基锆盐-枸橼酸反应 鉴别黄酮类化合物中是否

3、存在3-羟基或5-羟基氨性氯化锶反应 邻二酚羟基主要反应三氯化铁反应 酚羟基主要反应硼酸显色反应硼酸显色反应 5-羟基黄酮或羟基黄酮或6-羟基查耳酮主要反应羟基查耳酮主要反应碱性试剂反应碱性试剂反应五氯化锑反应五氯化锑反应 鉴别查耳酮鉴别查耳酮Gibbs反应和反应和Emerson反应反应 鉴别黄酮类化合物酚羟基对位鉴别黄酮类化合物酚羟基对位上是否被取代上是否被取代v色谱法色谱法 1.薄层色谱法薄层色谱法硅胶-分离鉴别弱极性黄酮类化合物遵循正相色谱原理，化合物极性越大，所选择的展开剂极性也相应增大，同时根据化合物酸性强弱调节展开剂的酸碱性。常用展开剂有苯-甲醇等。聚酰胺-分离检识含游离酚羟基的黄

4、酮及其苷利用氢键吸附原理，由于聚酰胺和黄酮类化合物上酚羟基形成氢键缔合，所以作用力较强，需要极性强的展开剂，而在展开剂中大多含有醇、酸或水，或兼有两者。所以，分离检识游离黄酮常用有机溶剂作为展开剂，如氯仿- 甲醇等；而分离检识黄酮苷常用含水有机溶剂作为展开剂，如甲醇- 水等。纤维素-分离黄酮类多糖苷混合物展开系统：正丁醇-乙酸-水，5%40%乙酸 展开好的色谱，常在紫外灯（365nm）下观察荧光斑点及其颜色；亦可喷三氯化铝试剂，在日光灯或紫外灯下观察荧光是否加强；也可氨熏，是否出现黄色、棕色荧光斑点等。 2.纸色谱法纸色谱法 适用于分离各种类型的黄酮化合物，包括游离黄酮和黄酮苷类。 混合物的检

5、识常采用双向色谱法，第一向采用醇性展开剂如正丁醇-乙酸-水（4:1:5上层，BAW）等，此为正相分配色谱，极性小的化合物比极性大的化合物Rf值大。第二向采用水性展开剂，如水、 2%6%乙酸等，其色谱行为类似于反向色谱，极性大的化合物比极性小的化合物Rf值大。 游离黄酮类化合物的检识，一般宜用醇性展开剂；花色素及花色苷的检识可用含盐酸或乙酸的水溶液作展开剂。 多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外灯检查时，可以看到有色点，以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。此外，还可以喷以2%AlCl3甲醇溶液（在紫外灯下检查）或1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6(1:1)水溶液等显色剂。三、含量测定三、含量测定

6、 中药制剂中含有黄酮类成分，可按要求测定总黄酮含量、黄酮类单体含量或两者均须测定。含量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法等。（一）、总黄酮含量测定（一）、总黄酮含量测定 分光光度法一般用于总酮类成分的含量测定。大多数黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。 带出现在300400nm之间的吸收带 带出现在240285nm之间的吸收带 含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经必要的提取纯化后，可直接于最大吸收波长附近测定总黄酮的吸光度，对照品的选定应以最大吸收波长与总黄酮的相近为原则，单体黄酮和总黄酮均可作为对照品，常以芦丁等对照品计算总黄酮的含量。 毛冬青注射液中

7、黄酮苷的测定（书P132）（二）、单体黄酮含量测定（二）、单体黄酮含量测定v薄层扫描法样品经适宜的溶剂提取得到供试液，经硅胶、聚酰胺或纤维素薄层 色谱有效分离后，用薄层扫描仪直接进行含量测定。对黄酮类单体 既可以进行紫外-可见光扫描，又可以进行荧光扫描。v高效液相色谱法正相色谱(多用于没有羟基或乙酰化黄酮类成分化合物） 固定相为硅胶，流动相可套用薄层色谱条件，但极性要相对小一点。反相色谱（C18或C8） 固定相多为十八烷基硅烷键合相 流动相：甲醇-水-乙酸（磷酸缓冲液），乙腈-水v检测器：紫外检测器或荧光检测器 心通口服液中葛根素的含量测定（书P133）银杏叶提取物银杏叶提取物总黄酮醇苷总黄酮

8、醇苷含量含量测定测定 含量测定含量测定 色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500，山柰素酚峰与异鼠李素峰的分离度应大于1.5。 对照品溶液的制备对照品溶液的制备（略） 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约相当于总黄酮醇苷19.2mg的粉末，精密称定，精密加入甲醇20ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置100ml锥形瓶中，加甲醇10ml、25%盐酸溶液5ml，摇匀，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用