丙二醛含量测定学习资料

1、丙二醛含量测定精品文档植物组织中丙二醛含量测定方法一：一、目的通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。二、原理丙二醛（ MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜 脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。 测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸 （TBA）在酸性条件下加热与组 织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（ 3、5、5三甲基恶唑 2、 4二酮），三甲川最大的吸收波长在 532nm。但是测定植物组织中 MDA时受多 种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的 最大吸收波长在 450nm处，在

2、532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温 等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应 产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在 532nm波长处尚有非特异的背 景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖 或丙二醛显色反应物在 532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代 巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为 10 0300g·g1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入 Fe3的终浓度为 0.5nm ol · L1。在 532nm、 600nm和 450nm波长处测定吸光度

3、值，即可计算出丙二醛含 量。三、材料、仪器设备及试剂1. 材料： 植物叶片。2. 仪器设备： 离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（ 1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3. 试剂： 10三氯乙酸； 0.6 硫代巴比妥酸（ TBA）溶液：石英砂。四、实验步骤1. 丙二醛的提取称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片 1g，加入少量石英砂和 1 0三氯乙酸 2ml，研磨至匀浆，再加 8ml10三氯乙酸进一步研磨，匀浆以 40 00r/min 离心 10min，其上清液为丙二醛提取液。2. 显色反应及测定取 4 支干净试管，编号， 3 支为样品管（三个重复

4、），各加入提取液 2ml ， 对照管加蒸馏水 2ml，然后各管再加入 2ml 0.6 硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混 合液在沸水浴中反应 15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在 532、600 和 450nm波长下测定吸光度（ A）值。五、丙二醛含量计算：由于蔗糖 TBA反应产物的最大吸收波长为 450nm，毫摩尔吸收系数为 85. 4×103，MDATBA反应产物在 532nm的毫摩尔吸收系数分别是 7.4 ×103和 155 ×103。 532nm非特异性吸光值可以 600nm波长处的吸光值代表。按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及

5、可溶性糖浓度。方程组：A 450=（85.4 ×103）·C糖（A532A600）=（155×103）·CMDA+（7.4 ×103）·C糖 解得：A 4501C糖 = = 11.71A 450（mmo·lL1）85.4 ×10 31CMDA= 6.45 （A532A600） 0.56A 450- （mol·L ）公式中： A450在 450nm波长下测得的吸光度值A532在 532nm波长下测得的吸光度值A600在 600nm波长下测得的吸光度值5 1.55 ×105为摩尔比吸收系数C糖、 C

6、MDA分别是反应混合液中可溶性糖、 MDA的浓度1. 按下式计算提取液中 MDA浓度反应液体积（ ml）CMDA× 1000 提取液中 MDA浓度（mol·ml1） = 测定时提取液用量（ ml）2. 按下式计算样品中 MDA含量提取液中 MDA浓度（mol·ml1）×提取液总量（ ml）MDA含量（mol·g 1 Fw）植物组织鲜重（ g）收集于网络，如有侵权请联系管理员删除方法二 :一、原理丙二醛 （MDA） 是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以 与硫代巴比妥酸 （TBA） 反应生成红棕色的三甲川 （3，5，5-三甲基恶唑 -

7、 2，4。二酮 ），其最大吸收波长在 532nm 。测定植物组织中 MDA 时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性 糖，糖与 TBA 显色反应产物的最大吸收波长在 450nm ，但 532nm 处 也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因 此测定植物组织中 MDA-TBA 反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干 扰。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片（二）仪器设备：紫外可见分光光度计 1 台；离心机 1 台；电子天平 1 台；10ml 离心管 4 支；研钵 2 套；试管 4 支；刻度吸管：10ml1 支， 2ml1 支；剪刀 1 把。(三) 试剂：10 三氯乙酸

8、 (TCA) ；06硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠 (1mol ·L-1) 溶解，再用 10的三氯 乙酸定容；三、实验步骤1实验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。 2MDA 的提取 称取剪碎的试材 1g，加入 2mll0 TCA 和少量石英砂，研磨 至匀浆， 再加 8mlTCA 进一步研磨，匀浆在 4000r ·min-1 离心 10min ，上清 液为样品提取液。3显色反应和测定 吸取离心的上清液 2ml( 对照加 2ml 蒸馏水 )，加入 2ml06 TBA 溶液，混匀物于沸水浴上反应 15min ，迅速冷却后再离心。取上清 液测定 532

9、 、600 和 450nm 波长下的消光度。4计算含量(1)直线方程法MDA 与 TBA 显色反应产物在 450nm 波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗 糖(0-25mmol ·L-1)与TBA 显色反应产物在 450nm 的消光度值与 532nm 和 600nm 处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与 TBA 显色反应 后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在 532nm 处 的消光度值。UV-120 型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532 -0 O0l98 十 0088D450（1）（2）双组分分光光度法据朗伯一比尔定律： DkCL，当液层厚度为

10、1cm 时， kD C， k 称为该物质 的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于 此混合液在该波长下各显色物质消光度之和。已知蔗糖与 TBA 显色反应产物在 450nm 和 532nm 波长下的比吸收系数分别 为 8540、 740。MDA 在 450nm 波长下无吸收，故该波长的比吸收系数 为 0，532nm 波长下的比吸 系数为 155 ，根据双组分分光度计法建立方程 组，求解方程得计算公式： 式中C111 71D450（2）C26 45（D532-D600）-0.56D450（3）C1- 可溶性糖的浓度 （mmol ·L-1） ，C2MDA 的浓度（ umol ·L-1 ），D450 、0532 、D600 分别代表 450 、532 和 600nm 波长下的消光度值。 以直线方程法计算时，按公式（ 1）求出样品中糖分在 532nm 处的消光度值 Y532 ，用实测 532nm 的消光度值减去 6nm 非特异吸收的消光度值再减去 Y532 ，其差值为测定样品中 MDA-TBA 反应产物在 532nm 的消光度值。按 MDA 在 532nm 处的毫摩尔消光系数为 155