《生化实验技术》综合设计性实验论文

1、生化实验技术综合设计性实验论文 班级组别： 生物技术122 学 号： 2012013456 姓 名： 钮群崛 指导教师： 汪财生 谭志文 斯越秀 完成日期： 2014-6-26 海藻活性多糖的分离纯化摘要：海藻多糖属一类海藻提取物,应用价值很高,如:琼脂、卡拉胶、褐藻酸盐在工业上已长期使用。海藻多糖作为药物和药物中间体有具有潜在的功能。利用酶法去除多糖中的蛋白质并且运用酶法辅助提取多糖；采用苯酚硫酸法，借助紫外分光光度计进行对多糖含量的测定。关键词：海藻多糖，层析，透析，Sevag法，DEAE1前言 多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物

2、活性和功能。多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以-或-糖苷键所组成的化合物，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大基本物质之一，与维持生命功能密切相关。大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。多糖具有抗氧化性、抗病毒性、反互补特性，大量药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，能激活免疫受体，提高机体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好的优点。多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。常用的去

3、除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。本实验采用Sevag法(氯仿：正丁醇4：1混合摇匀)进行脱蛋白，用DEAE-纤维素层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖组分。DEAE纤维素阴离子柱层板分离多糖的原理主要是其可吸附离子型物质，比如蛋白质、酸性多糖等，而作为大多数的中性多糖则可顺利流出，从而去粗取精、达到分离的目的。当然，DEAE的细度很细，也可起到分子筛的作用

4、，但其分离效果会和柱高、洗脱溶剂、粒径的关系很大，效果并不很好，且在大量水冲的情况下，中性多糖基本均可洗脱下来。多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490nm处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，采用比色法对多糖含量进行测定。DEAE纤维素阴离子柱层板分离多糖的原理主要是其可吸附离子型物质，比如蛋白质、酸性多糖等，而作为大多数的中性多糖则可顺利流出，从而去粗取精、达到分离的目的。当然，DEAE的细度很细，也可起到分子筛的作用，但其分离效果会和柱高、洗脱溶剂、粒径的关系很大，效果并不很好，且在大量

5、水冲的情况下，中性多糖基本均可洗脱下来。2材料与方法2.1材料与设备2.1.1实验材料 干燥的海藻粉末2.1.2试剂及配制方法平衡缓冲液：0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2:用小烧杯称取1.211g Tris，用50ml蒸馏水溶解，用50%盐酸调节pH7.2，移至1000ml容量瓶，并定容。洗脱液：A：0.1mol/L NaCl,0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2:用小烧杯称取5.85g NaCl，用0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2溶解，并定容至1000ml。B: 0.5mol/L

6、 NaCl,0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2: 用小烧杯称取29.25g NaCl，用0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2溶解，并定容至1000ml。标准葡萄糖溶液（40ug/ml）：称取0.4g葡萄糖，用蒸馏水定容至100ml,准确移取1ml定容后溶液于100ml容量瓶中，并定容，此时的溶液浓度为40ug/ml。6苯酚溶液：取苯酚100 g，加铝片0. 1 g和碳酸钠0. 05 g，常压蒸馏,收集182馏分。称取该馏分(100%苯酚)6 g，置100

7、60;ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。  单糖标准品，浓硫酸，氯仿，正丁醇，乙醇（95%），磷酸二氢钠等，均为分析纯。2.1.3实验器材DEAE52,旋转真空蒸发仪，摇床，离心机，层析柱2.6cm*40cm，自动液相分析仪，玻璃板，分析天平，恒温水浴锅，紫外分光光度计，精密pH计等2.2实验方法2.2.1粗多糖的提取 热水浸提法（水提）：称取海藻粉末10g，采用热水浸提法（原料：水=1:5），在7080摄氏度下，浸提1小时，重复提取四次，合并浸提液。真空旋转蒸发浓缩一倍体积。2.2.2脱色处理 以1的比例加入活性炭，搅拌均匀15mi

8、n后过滤。滤液中加入3倍体积的乙醇搅拌，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，即粗多糖。2.2.3除蛋白 粗多糖溶液中加入Sevag法试剂（氯仿：正丁醇=4:1），置恒温振荡器中振荡过夜，使蛋白质充分沉淀，离心（3500r/min，15min），收集水层，除去蛋白层和有机溶剂层，水层继续重复该步骤到无游离蛋白为止，最终得到脱蛋白的羊栖菜多糖样品水相，真空旋转蒸发浓缩，加入4倍体积的95%乙醇沉淀多糖。丙酮沉淀，冷冻干燥。2.2.4浓缩透析 取样品0.2g溶于10ml 0.01mol/L Tris-HClpH7.2中（上样的时候用2ml），上样用A：0.1mol/L NaCl

9、,0.01mol/L Tris-HClpH7.2；B: 0.5mol/L NaCl,0.01mol/L Tris-HClpH7.2，C：1.0mol/L NaCl0.01mol/L Tris-HClpH7.2，进行线性洗脱，分部收集(4ml/管)，合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干。2.2.5多糖纯度的测定 分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml的标准葡萄糖液，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静置10min，摇匀，室温放置20 min后于490nm波长下测光密度，以2

10、.0ml水按同样显色操作作为空白。以横坐标为糖微克数，纵坐标为光密度值，作标准曲线。精确称取0.1g样品，配置成40ug/ml的糖溶液。吸取1ml上述糖溶液，蒸馏水1ml，然后加入6苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml。重复上述步骤50次。静置10min，摇匀，室温放置20 min后于490nm波长下测光密度，作出样品吸光值图。再把其值代入葡萄糖标准方程中，算出含糖量。 作出葡萄糖标准曲线图，作出样品吸光值图后，测其吸光值。再把其值代入葡萄糖标准方程中，算出含糖量。3结果与分析（1）多糖含量测定0123456标准葡萄糖溶液（ml）00.40.60.81.01.21.4蒸馏水（ml）2.0

11、1.61.41.21.00.80.66%苯酚（ml）1.0浓硫酸（ml）5.0A00.0450.0740.1080.1420.1250.153（2）多糖活性测定1324 峰1234A0.0520.0010.0310.193根据标准曲线的到峰1多糖浓度为：8.7×10-3mg/ml， 峰2为：1.7×10-4mg/ml，峰3为：5.2×10-3mg/ml，峰4为：3.2×10-2mg/ml对第4个峰进行海藻多糖的活性测定 编号 4 A0 0.520 Ai -0.193 Aj -0.230S A( % ) = 1- ( A i- Aj ) / A0 

12、5;100%=92.88%4. 结论对分离等到的4种多糖进行含量的分析其中第4个峰的多糖含量最高，DPPH的分析结果为4种糖都有清除自由基的能力其中第4个峰清除自由基的能力最强。参考文献：1 陈彦,谢继锋,金先菊等.海藻多糖的分离纯化和组成分析J. 安徽农业科学,2003,31(5):710-717.2 王长海.海洋生化工程概论M. 化学工业出版社,2004:121-127.3 王安利,胡俊荣. 海藻多糖生物活性研究进展J. 海洋科学,2002,26(9):36-39.定性PCR检测转基因大豆摘要：“转基因食品”（GM FOOD）如今已经在世界上多个国家成了环境和健康的中心议题。并且，它还在迅

13、速分裂着大众的思想阵营：赞同它的人认为科技的进步能大大提高我们的生活水平，而畏惧它的人则认为科学的实践已经走得“太快”了。转基因食品，就是指科学家在实验室中，把动植物的基因加以改变，再制造出具备新特征的食品种类。许多人已经知道，所有生物的 DNA上都写有遗传基因，它们是建构和维持生命的化学信息。通过修改基因，科学家们就能够改变一个有机体的部分或全部特征。关键词：PCR、转基因大豆 ，核酸1前言PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段

14、两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下以dNTP为原料，引物沿53方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴

15、化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在；在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。2材料与方法2.1材料与设备2.1.1实验材料 转基因大豆，非转基因大豆标样2.1.2试剂及配制方法1.0.1mol/lTris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.32.0.02mol/lEDTA,P

16、H.8.03.异戊醇（24:1，V/V)4.氯仿（24:1，V/V)5.70%乙醇6.0.6ml-20的异丙醇7.TE溶液（10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA ，pH8.0)8.Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取10.78gTris，5.50g硼酸，9.0.93g EDTA-Na2溶于去离子水，定容至1000mL。10.琼脂糖： 1g 溶于TBE缓冲液中加热配成100mL。11.0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5×Loading Buffer ） ：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。12.0.5g/mL溴化乙啶染色

17、液：称取5mg溴化乙啶，用去离子水溶解，定容至100mL。从中取1mL，用无离子水稀释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。）RNA酶溶液：5ug/uL2.1.3实验器材 紫外分光光度计、高速离心机，PCR扩增仪，微量移液枪，水平电泳仪材料和试剂2.2实验方法1.（1）大豆基因组DNA的提取DNA的提取和纯化洗干净大豆叶片，用75%的酒精表面消毒3min, 用去离子水冲洗34次（2）称取1g叶片放入灭过菌的研体中，加入液氮捣碎，迅速转入2ml离心管中。（3）加入600µl CTAB缓冲液，震荡均匀，65温育30min. 加入500ul 酚

18、：三氯甲烷：异戊醇（25:24:1），振荡均匀，12000r/min， 离心15min。 （4）吸取上清液，放入另一新管中，加入等体积的异丙醇，12000r/min，离心10min。（5）弃去上清液，加入70%乙醇溶液洗涤，12000r/min，离心1min。（6）弃去上清液，干燥，用50µl TE溶液溶解沉淀。（7）加入5µl RNA酶溶液，37温育30min。（8）加入400µl的CTAB溶液，振荡均匀。（9）加入250µl的三氯甲烷：异戊醇，振荡均匀，12000r/min，离心15min。（10）吸取上清液，

19、放入另一个新管中，加入200µl的异丙醇，12000r/min， 离心10min。 （11）弃去上清液，干燥，用50µl TE缓冲液溶解沉淀。2.紫外分光光度法取5ulDNA样品或4ulRNA样品加水到lml。 (2)用lml水做空白。 (3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。 (4)每ul中DNA或RNA浓度(ug)将是OD值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD值为0.2，则原DNA或RNA样品浓度为2ugul。(5)测280nm处OD值，计算二者的比率，若比率接近2，则说明样品中核酸比较纯。若比率小于1.6

20、，则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中，建议再用酚氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。DNA分子大小测定（琼脂糖凝胶电泳）(1)用1×TBE电泳缓冲液0.8琼脂糖凝胶，加溴化乙锭其终浓度为0.5ugm1。 (2)加热使琼脂糖熔化均匀，取出室温冷却至50-60。 (3)取一块5×7cm玻璃板，置水平台上，放一微型点样梳，点样梳底部离玻璃平板的距离为0.5-1. 0mm。 (4)将凝胶小心倒在玻璃板上，待冷却后取出点样梳，保持点样孔的完好。 (5)取DNA样品及DNA标准浓度各lul加入1×TBE4ul，加入6×

21、;上样缓冲液lul，混 匀。 在0.8琼脂糖凝胶点样孔小心点样，记录样品点样次数与点样量。 打开电源开关，电压不超过5Vcm，一般40V，30-40分钟。(8)取出泳动后的凝胶板，翻转玻璃盖在紫外分析仪观察DNA区带。(9)DNA含量的估计：比较待测DNA的条带与已知DNA的各条带的荧光密度，估计待测DNA在凝胶中的含量，再估计出其浓度。4.PCR扩增PCR的扩增与分子量的测定（1）无菌ddH2O21.5ulTaq酶等25ul引物1（68）0.6ul        引物2（69）0.9

22、ul模板DNA2ul混匀后，离心5000r/min×1min，置PCR仪（2）PCR扩增的设定：设置PCR扩增仪的热盖温度为100预变性：945min循环：94变性30s56退火30s30个循环72延伸30s末次延伸：725min4保存（3）用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物操作要点：PCR过程中，应预防DNA污染；用无菌水配制所有溶液；塑料用品用0.5MNaOH浸泡10分钟；。PCR反应条件扩增目的基因 预变性 循环(30个循环) 末次延伸Lectin 94,1min 94,30s 72,5min54,40s72,1minCaMV 35S 94,3min 94,30s 72,7min5

23、4,1min72,30s3结果与分析测定DNA含量及纯度为防止实验偶然性造成实验误差，我们小组做了3组实验，其中一组的样品在各波长下的吸光度如下：基因组DNA的提取和纯化电泳图分析：通过测量各个吸光度下样品的波长，A260/A280=1.945第二份和第三份样品各为1.927和1.993，比值大于1.8（DNA）A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 ，但实验样品一测得A260/A230=0.775，样品中可能存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，样品二较为理想A260/A230=1.829，样品三是1.893。在核酸提取出来跑电泳时，如上图所示，只出现了三个样品的条带，每个样品各跑了两条，其中第三份样品的第一个条带途中有明显的拖带现象说明有一部分是RNA。有杂蛋白残留，且DNA也发生了降解。可能是由于加入三氯甲烷-Tris饱和酚后，混匀不够充分肌源离心因而蛋白质没有完全溶于酚中，造成蛋白质残留。提取过程中DNA降解了，因为不可能将RNA完全去除，和在提取时不可避免的将DNA打断为更小，所以肯定存在一条较长的拖尾，有些RNA去除不好的还会在