D-塔格糖生物转化的研究进展

1、沐万孟沐万孟Contents塔格糖的塔格糖的 塔格糖的生理活性和功能塔格糖的生理活性和功能塔格糖的理化性质塔格糖的理化性质属属 性性值值化学家族化学家族 碳水化合物，单糖，己酮糖，碳水化合物，单糖，己酮糖，D-半乳半乳糖的异构体糖的异构体 分子式分子式 C6H12O6 分子量分子量 180物理性状物理性状 白色晶体白色晶体 气味气味 无无熔点熔点 134 pH范围范围 2.0 - 7.0 溶解性溶解性 58% w/w （21） 相对甜度相对甜度 为蔗糖的为蔗糖的92%（10%溶液中）溶液中） 冷却效应冷却效应 无无卡路里值卡路里值 1.5 kcal/g 美拉德反应和焦糖化反应美拉德反应和焦糖化

2、反应 是是 塔格糖的生理活性和功能塔格糖的生理活性和功能 美国美国Spherix公司公司生产的塔格糖名称生产的塔格糖名称塔格糖代谢途径塔格糖代谢途径高等动物高等动物 由于不具塔由于不具塔格糖格糖-6-磷酸途径，因此磷酸途径，因此D-塔格糖不能被自然地塔格糖不能被自然地代谢。代谢。 塔格糖的应用现状塔格糖的应用现状v20002000年年FDAFDA已正式批准塔格糖作为甜味剂用于食品饮料业已正式批准塔格糖作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；以及医药制剂中；vJECFAJECFA（联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂（联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会）第委员会）第5757次

3、会议批准塔格糖作为食品添加剂，推荐次会议批准塔格糖作为食品添加剂，推荐ADIADI值值0-80mg/kg0-80mg/kg；v欧盟也于欧盟也于20032003年批准塔格糖在欧洲上市；年批准塔格糖在欧洲上市；v目前塔格糖在美国已被大量用于健康饮料以及酸奶、果目前塔格糖在美国已被大量用于健康饮料以及酸奶、果汁等产品中作为白糖的代用品。塔格糖产品目前已获得汁等产品中作为白糖的代用品。塔格糖产品目前已获得美国、澳大利亚、日本、韩国等食品卫生部门批准使用，美国、澳大利亚、日本、韩国等食品卫生部门批准使用，在我国仍未获得批准使用。在我国仍未获得批准使用。塔格糖的应用现状塔格糖的应用现状v20062006年

4、年8 8月百事可乐公司正式在雪碧饮料中使用塔格糖，月百事可乐公司正式在雪碧饮料中使用塔格糖，作为风味的强化剂，这是塔格糖第一次进入商业领域。作为风味的强化剂，这是塔格糖第一次进入商业领域。 v20072007年新西兰年新西兰MiadaMiada运动营养食品公司将塔格糖应用于巧运动营养食品公司将塔格糖应用于巧克力产品的开发，五月投放澳大利亚和新西兰超级市场。克力产品的开发，五月投放澳大利亚和新西兰超级市场。据据BCCBCC预测，新进入市场的塔格糖将会以一种稳定的速度预测，新进入市场的塔格糖将会以一种稳定的速度增长，估计在今后五年内为增长，估计在今后五年内为20202525。 关于塔格糖的专利情况

5、关于塔格糖的专利情况v 2000 Process for manufacturing D-tagatose 从干酪乳清、牛奶或其混合物中利用若干步骤（包括从干酪乳清、牛奶或其混合物中利用若干步骤（包括L- L- AI AI 催化）产生催化）产生D-D-塔格糖，涉及了许多常温菌属。塔格糖，涉及了许多常温菌属。v2005 Thermostable L-AI and process for preparing D-tagatose （韩国） 利用源自耐热菌属利用源自耐热菌属ThermotogaThermotoga neapolitananeapolitana的热稳定的热稳定L-L-AIAI生产塔格糖

6、生产塔格糖 ，及其基因表达，及其基因表达关于塔格糖的专利情况关于塔格糖的专利情况v2006 Process for manufacturing of tagatose （丹麦）（丹麦） Bacillus, Sulfolobus, Thermoanaerobacter or Thermotogav2006 Thermostable isomerase and use hereof, in particular for producing tagatose （丹麦）（丹麦） Thermoanaerobacter species such as Thermoanaerobacter mathrani

7、i生物法生产塔格糖的最新进展生物法生产塔格糖的最新进展生物法生物法化学法化学法化学污染物化学污染物碱性条件副产物碱性条件副产物 多多分离困难分离困难vJung-Woo KimJung-Woo Kim等利用大等利用大肠杆菌克隆表达了耐热肠杆菌克隆表达了耐热均均ThermusThermus sp. IM6501 sp. IM6501的的AIAI，该酶最适，该酶最适pHpH和温和温度分别为度分别为8.08.0和和6060，并，并且且60U60U该酶在该酶在10mL 0.1%10mL 0.1%半乳糖溶液中反应半乳糖溶液中反应3 3天最天最终转化率达终转化率达54%54%。v 研究了耐热酶研究了耐热酶B

8、HAI和和GSAI对金属的依赖性及对金属的依赖性及对金属与酶的构相及活性对金属与酶的构相及活性之间的关联。之间的关联。BHAI无金无金属依赖性，属依赖性，GSAI的活性的活性受受Mn2+的的 影响。推测金影响。推测金属在较高的温度下属在较高的温度下 调节着调节着该酶的活性三级结构。该酶的活性三级结构。BHAIGSAIv首次研究了首次研究了嗜酸耐热菌嗜酸耐热菌的的AI,AI,最适最适pHpH为为6.0-6.56.0-6.5，并与源自耐热菌并与源自耐热菌B.haloduranceB.halodurance 的的AIAI（最适最适pHpH为为7.5-8.07.5-8.0）进行比较研究，得到两进行比较

9、研究，得到两种突变酶种突变酶K269EK269E和和E268KE268K，Lys-296Lys-296 对对pHpH有重要作有重要作用。用。 v在大肠杆菌中表达了源在大肠杆菌中表达了源自耐热菌自耐热菌ThermoanaerobacterThermoanaerobacter mathraniimathranii的的AIAI，并研，并研究了双酶及三酶偶联连究了双酶及三酶偶联连续化反应器生产塔格糖续化反应器生产塔格糖及混合糖浆。及混合糖浆。25h25h后，后，塔格糖含量可达塔格糖含量可达200mM200mM G. G. thermodenitrificansthermodenitrificans L

10、-AIL-AI经过单点和双点定点经过单点和双点定点突变技术，获得突变技术，获得2 2个突变个突变点的酶（分别是点的酶（分别是N475KN475K单单点突变点突变 和和 C450S-N475K C450S-N475K双点突变），经检测，这双点突变），经检测，这两种突变酶的酶活为原始两种突变酶的酶活为原始酶的酶的1.71.7和和2.62.6倍。而且使倍。而且使塔格糖的转化率也分别提塔格糖的转化率也分别提高高12%12%和和20%20%。vMoezMoez RhimiRhimi等在大肠杆菌中表等在大肠杆菌中表达了达了B.stearothermophilusB.stearothermophilus U

11、S100US100的的AI,AI,该酶无金属依赖性该酶无金属依赖性并且热稳定性高，最适并且热稳定性高，最适pHpH和温和温度分别为度分别为7.57.5和和80,3mg80,3mg酶在含酶在含有有5mM5mM半乳糖的体系中在半乳糖的体系中在70 70 时时7h7h转化率达转化率达48%48%。(51U/mg)(51U/mg)657570v大肠杆菌大肠杆菌L-AI单体含有单体含有498个氨基酸残基，其个氨基酸残基，其晶体结构如左图，由晶体结构如左图，由16个个折叠和折叠和17个个螺旋螺旋构成，可分为三个结构构成，可分为三个结构域：域：N-端结构域（端结构域（1-176 Aa）、中间结构）、中间结构

12、域（域（177-327 Aa）和）和C-端结构域（端结构域（328-498 Aa）。）。 大肠杆菌大肠杆菌L-AI晶体结构带状图晶体结构带状图l大肠杆菌大肠杆菌L-AIL-AI发挥酶的活性需要在发挥酶的活性需要在三聚体下才能发挥，分别记号为三聚体下才能发挥，分别记号为A A、B B、C C。l三聚体的外表面显示出三个等价的三聚体的外表面显示出三个等价的裂口，裂口的组成为裂口，裂口的组成为一个亚基的一个亚基的C-C-端结构域和中间结构域与另一个亚端结构域和中间结构域与另一个亚基的基的N-N-端结构域构成端结构域构成 l沿着裂口的氨基酸残基在嗜温、嗜沿着裂口的氨基酸残基在嗜温、嗜热和高度嗜热的热和

13、高度嗜热的L-AIL-AI中都非常保守，中都非常保守，这些残基大多位于一个环区域，表这些残基大多位于一个环区域，表明其可能为调节结构以调节活性位明其可能为调节结构以调节活性位点中底物进入和产物释放时的立体点中底物进入和产物释放时的立体结构。结构。 大肠杆菌大肠杆菌L-AI的裂口的裂口氨基酸组成与空间结构氨基酸组成与空间结构推测的酶结合与催化中心推测的酶结合与催化中心A. Glu306的的O2亲核进攻亲核进攻D-半乳半乳糖糖C-2的氢原子使其去质子化，的氢原子使其去质子化，形成碳碳双键，碳氧双键断裂，形成碳碳双键，碳氧双键断裂，形成氧负离子，氧负离子结合形成氧负离子，氧负离子结合质子，最终形成质

14、子，最终形成ene-diol（烯（烯二醇）中间体；二醇）中间体；B. Glu333的的O2亲核进攻亲核进攻D-半乳半乳糖糖C-2的羟基氢，生成的羟基氢，生成C-2位置位置的碳氧双键，的碳氧双键，C-1与与C-2之间的之间的碳碳双键断裂，生成碳负离子，碳碳双键断裂，生成碳负离子，结合质子，最终生成结合质子，最终生成D-塔格糖。塔格糖。推测的酶反应机理推测的酶反应机理烯二醇中间体反应机理烯二醇中间体反应机理ABCHv固定化表达源自耐热菌固定化表达源自耐热菌ThermotogaThermotoga neapolitananeapolitana AIAI的大肠杆菌细胞以进一的大肠杆菌细胞以进一步提高热

15、稳定性生产塔格步提高热稳定性生产塔格糖。最适温度由糖。最适温度由8585提高到提高到9090， 70 70 时的半衰期时的半衰期由由0.8h0.8h提高到提高到1.3h1.3h。2.5U2.5U酶量，在酶量，在12mL 0.5M12mL 0.5M半乳半乳糖体系中糖体系中20h 20h 转化率超过转化率超过50%50%。vMoezMoez RhimiRhimi等首次在大肠杆菌等首次在大肠杆菌中共表达分别源自中共表达分别源自Bacillus Bacillus stearothermophilusstearothermophilus US100 US100和和StreptomycesStreptom

16、yces SK SK的的 L-L-arabinosearabinose isomeraseisomerase和和d-d-glucoseIsomeraseglucoseIsomerase，并固定化，并固定化该细胞以同时生产塔格糖和果该细胞以同时生产塔格糖和果糖，两酶的最佳糖，两酶的最佳pHpH都为都为7.57.5，最适反应温度分别为最适反应温度分别为8080和和8585。经过经过8 8次重复利用后，该细胞次重复利用后，该细胞中两种酶活仍保持中两种酶活仍保持70%70%以上，以上，单批转化率为果糖单批转化率为果糖10%10%，塔格，塔格糖糖20%20%。vDeokDeok Kun Oh Kun O

17、h等人筛选出等人筛选出了两个对源自了两个对源自G.stearothermophilusG.stearothermophilus AIAI的的pHpH有影响的突变点有影响的突变点并对其进行突变，突变酶并对其进行突变，突变酶Q408VQ408V和和R408VR408V的最佳的最佳pHpH值都从值都从8.58.5改为改为7.57.5，最，最适条件下酶活分别提高适条件下酶活分别提高60%60%和和30%30%。GSAIR408VR408VQ408V来来 源源最适温度最适温度（ ）最适最适pH半衰期半衰期（min）B. stearothermophilus US100807.5-8.0110（75 ）T

18、hermus sp.608.5G. stearothermophilus T6707.0-7.552 (80 C)Thermotoga maritima907-7.5185 (90 C)Thermotoga neapolitana857.0120 (90 C)Bacillus halodurans507.5-8.020 (70 C)Alicyclobacillus acidocaldarius 656.0-6.5国外主要研究热点国外主要研究热点v目前关于目前关于L-AI的研究主要集中在嗜热菌，热稳的研究主要集中在嗜热菌，热稳定性酶有利于工业化生产。定性酶有利于工业化生产。v利用分子生物学手段对

19、嗜热菌利用分子生物学手段对嗜热菌L-AI进行大量表进行大量表达，提高产酶率。达，提高产酶率。v对嗜热菌对嗜热菌L-AI进行分子水平的改造，如改变进行分子水平的改造，如改变pH和酶活的突变等，以适合塔格糖的工业化生产。和酶活的突变等，以适合塔格糖的工业化生产。本实验室研究情况本实验室研究情况v筛选得到一株产筛选得到一株产L-AI的植物乳杆菌。的植物乳杆菌。v建立了体系，并对产酶体系进行了优化。建立了体系，并对产酶体系进行了优化。v对该酶进行了分离纯化，并研究了其性质。对该酶进行了分离纯化，并研究了其性质。 最适温度和最适温度和pH值分别为值分别为60和和7.0。 存在的问题存在的问题v酶活不高。

20、酶活不高。0.049U/mLv酶热稳定性不高，在酶热稳定性不高，在60时半小时失活时半小时失活50%。菌种菌种酶活酶活(U/mL发酵发酵液）液）比酶活比酶活(U/mg蛋白蛋白质质)转化率转化率反应反应温度温度()最适最适温度温度()pH出处出处Recombinant E. coli (Thermus.spIM6501)4.60.19(纯酶纯酶)54%底物底物 1g/L酶量酶量 40U反应时间反应时间 72h60658.0Biotechnology Letters2003Mutants of Geobacillus thermodenitrificans0.42(单点单点)0.57(双点双点)(

21、纯酶纯酶)55%和和58%底物底物 1.8g/L反应时间反应时间 6.7h65658.5Biotechnology Letters2006Recombinant E. coli(Thermoanaerobacter mathranii) 厌氧厌氧4.0(纯酶纯酶)25%底物底物 300g/L时间时间 48h65657.0Appl Microbiol Biotechnol2004Recombinant E. coli(Thermotoga neapolitana)15.56(以阿拉伯以阿拉伯糖为底物糖为底物)120(以阿拉伯以阿拉伯糖为底物糖为底物)68%底物底物 1.8g/L时间时间 20h8

22、0857.0FEMS Microbiology Letters2002Recombinant E. coli(Bacillus stearothermophilus US100)185(纯酶纯酶)48%底物底物 0.9g/L酶量酶量555U (3mg)时间时间7h70807.5Biochimica et Biophysica Acta2006Lactobacillus plantarum SK-2厌氧菌厌氧菌0.0491.4(纯酶纯酶)39%底物底物100g/L酶量酶量 120U时间时间 96h35607.0World J Microbiol Biotechnol2006小结小结乳糖乳糖半乳糖半乳糖塔格糖塔格糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶LL阿拉伯糖异构酶阿拉伯糖异构酶pH5.0-7.0pH7.0-8.5因此需要寻找最适因此需要寻找最适pHpH为为酸性酸性范围的范围的L-AIL-AI的酶源的酶源或通过一定手段改变酶的最适或通过一定手段改变酶的最适pHpHv 资料报道高温条件下（资料报道高温条件下（60）有利于醛酮糖异构反应，）有利于醛酮