基因工程111工具酶

1、生化与分子生物学技术和原理生化与分子生物学技术和原理欢 迎 学 习 本 课 程，请 多 提 宝 贵 意 见！主讲：蒋德明主讲：蒋德明 实验实验b b楼楼309309 54341957 54341957 基因克隆与表达部分基因克隆与表达部分供体细胞载体分子外源dna外源基因分离酶切酶切连接转化扩增dna重组分子受体细胞鉴定与表达重组转化子工程菌或细胞蛋白产物工程菌或细胞培养重组产物分离纯化基因克隆与表达基因克隆与表达一基因克隆的基本元件二pcr及文库克隆法三dna重组及转化技术四转化子的筛选与鉴定五原核生物表达系统一 基因工程的基本元件 -工具酶l 限制性内切酶ldna连接酶ldna聚合酶l逆转

2、录酶l dna修饰酶 第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶定义定义: :能够能够识别识别和和切割切割双链双链dna(dsdna)dna(dsdna)分子内分子内特异特异核苷酸核苷酸 顺序的核酸内切酶顺序的核酸内切酶, ,叫做限制性核酸内切酶叫做限制性核酸内切酶. .主要特征i型ii型iii型切割位点距寄主特异性位点至少数百bp的部位可能随机的切割位于寄住特异性位点或两侧距寄住特异性位点3端24-26 bp处序列特异的切割不是是是三种类型核酸内切酶特性差异一、ii型限制性内切酶切割类型1、平齐末端（blunt end）hind ii 切割反应切割反应sma i 切割反应切割反应2.1 2.1

3、产生产生5 5粘性末端粘性末端 5 5-g a-a-t-t-c-3-g a-a-t-t-c-3 3 3 c-t-t-a-a-g-5 c-t-t-a-a-g-5 5 5-g-3-g-3 5 5-a-a-t-t-c-3-a-a-t-t-c-33 3-c-t-t-a-a-5-c-t-t-a-a-5 3 3-g-5-g-5 2.22.2产生产生3 3粘性末端粘性末端 5 5-c-t-g-c-a-g-3-c-t-g-c-a-g-3 3 3-g a-c-g-t-c-5-g a-c-g-t-c-5 5 5-c-t-g-c-a-3-c-t-g-c-a-3 5 5-g-3-g-3 3 3-g-5-g-5 3 3

4、-a-c-g-t-c-5-a-c-g-t-c-5 ecoriecoripstipsti2、粘性末端（sticky end）同尾酶 这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。相同的粘性末端。g-g-a-t-c-cc-c-t-a-g-gbamh it-g-a-t-c-aa-c-t-a-g-tbcl ia-g-a-t-c-tt-c-t-a-g-abgl iig-a-t-cc-t-a-gsau 3a iu-g-a-t-c-yy-c-t-a-g-uxho iiu表示嘌呤（a或g）y表示嘧啶（t或c）5-g-a-t-c3- -3

5、c-t-a-g-5+二、ii型限制性内切酶重要概念酶的星号活性 当酶切条件改变时，酶的专一性可能会降低，以至于同一种当酶切条件改变时，酶的专一性可能会降低，以至于同一种酶可识别和切割多个的位点。酶可识别和切割多个的位点。低盐（低盐（50mm50mm）、高）、高phph（88）、高甘油浓度）、高甘油浓度ecor i*ecor ig-a-a-t-t-cc-t-t-a-a-gg-a-a-t-t-ac-t-t-a-a-ta-a-a-t-t-ct-t-t-a-a-gg-a-g-t-t-cc-t-c-a-a-g双酶切方法v同步双酶切v分步双酶切三、限制性内切酶分析方法http:/ 定义：定义：能够催化双链

6、分子中相邻的能够催化双链分子中相邻的3 3-oh-oh和和5 5-p-p末端末端之间形成磷酸二酯键之间形成磷酸二酯键, ,使使dnadna分子连接起来的酶分子连接起来的酶. .一、种类一、种类 1.1 t4-dna1.1 t4-dna连接酶连接酶 从从t4t4噬菌体感染的大肠杆菌提取噬菌体感染的大肠杆菌提取1.2 1.2 大肠杆菌大肠杆菌dnadna连接酶连接酶二、二、dnadna连接酶的连接范围连接酶的连接范围 1.1.粘性末端粘性末端dnadna连接连接2.2.缺口的填补缺口的填补3.3.平末端平末端dnadna连接连接5 53 33 35 55 53 33 35 5p pp pohoho

7、hoh5 53 33 35 5p pohohrnarnadnadna5 53 33 35 5ohohohohp pp p5 53 33 35 55 53 33 35 5mgmg2+2+,atp,atpmgmg2+2+,atp,atpmgmg2+2+,atp,atpt4-dna t4-dna 连接酶连接酶t4-dna t4-dna 连接酶连接酶t4-dna t4-dna 连接酶连接酶t4-dna t4-dna 连接酶各种催化反应活性连接酶各种催化反应活性三、三、dnadna连接酶的连接条件连接酶的连接条件 1.1.双链双链dnadna分子分子 2.2.具有具有3 3-oh-oh和和5 5-p-p

8、3.3.缺口处不缺核苷酸缺口处不缺核苷酸 缺失核苷酸的裂口缺失核苷酸的裂口丢失磷酸二酯键的缺口丢失磷酸二酯键的缺口3 35 5连接酶封闭缺口连接酶封闭缺口连接酶无法封闭缺口连接酶无法封闭缺口无活性无活性（a a）（b b）五、五、t4 dnat4 dna连接酶的反应条件连接酶的反应条件10t4 dna ligase buffer 2.5 l dna片段* 约0.3 pmol 载体dna* 约0.03 pmol t4 dna ligase 1 l ddh2o up to 25 l 反应温度反应温度1616度，连接过夜。度，连接过夜。* dna片段的摩尔数应控制在载体dna摩尔数的310倍。 dn

9、adna聚合酶的特点：聚合酶的特点： 1.以四种脱氧核糖核苷酸为底物 2.需模板dna； 3.需引物； 4.新链的合成方向为5-3dnadna聚合酶聚合酶三、三、dnadna聚合酶的活性聚合酶的活性1. 51. 53 3聚合酶活性聚合酶活性2. 52. 53 3外切酶活性外切酶活性 3. 33. 35 5外切酶活性外切酶活性 裂口裂口缺口缺口四、四、klenowklenow酶酶1.来源：来源： dnadna聚合酶聚合酶枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶c c端端(67kd) + n(67kd) + n端（端（35kd35kd） klenow5 3聚合3 5外切5 3外切2.klenow2.kleno

10、w酶的三维结构酶的三维结构53355335533553355335* * * * * * *(a)(b)(c)(d)(e)(a)dnasei处理双链的dna分子(b)带有3-oh末端的单链缺口(c) pol从5-p移去一个核 苷酸(d) pol将32p标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5-3方向移动，形成32p标记的核苷酸合成的dna链五、五、dnadna聚合酶的应用聚合酶的应用 1.1.制备制备dnadna分子杂交探针分子杂交探针( (缺口平移缺口平移nick translation)nick translation) 五、五、dnadna聚合酶的应用聚合

11、酶的应用 2.2.制备制备dnadna分子杂交探针分子杂交探针( (随机引物法随机引物法) ) 五、五、dnadna聚合酶的应用聚合酶的应用 4.4.测序（测序（t7 dnat7 dna聚合酶）聚合酶）(sanger(sanger双脱氧链终止法）双脱氧链终止法） a) 53聚合，持续反应时间最长b) 35外切，是dna 聚合酶的 1000倍。2,3-双脱氧的a, c, g, t核苷三磷酸(称为ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp) 5.1 来源： 水生栖热菌(thermusaquaticus)yt15.2 活性： 聚合最适温度为75-80， 不具35外切酶活性， 具53外切活性

12、 。五、五、dnadna聚合酶的应用聚合酶的应用5.pcr5.pcr反应（反应（taqtaq dna dna聚合酶）聚合酶） 反转录酶（reverse transcriptase） 酶类别amvm-mlv肽链（62 kda)（94 kda) 84 kda5-3聚合活性+rnase h+一、来源：商品反转录酶有两种 来自禽类成髓细胞瘤病毒(amv)。 来自moloney鼠白血病毒(m-mlv)反转录酶二、结构和活性：依赖依赖rnarna的的dnadna聚合酶活性聚合酶活性 t t t t t t t-oh t-oh t t t t t t t tagacag agacag aaaaucuguc

13、aaaaucuguc aaaaucuguc aaaaucuguc 逆转录酶逆转录酶mgmg+ 4dntp 4dntp 依赖于依赖于dnadna的的dnadna聚合酶活性聚合酶活性 5 5 3 3 ssdnassdna5 5 3 3 逆转录酶逆转录酶 mg mg 4dntp4dntp 外切外切rnarna酶活性酶活性 (rna(rna酶酶h)h) + +寡聚寡聚rnarna片段片段 逆转录酶逆转录酶 rna/dnarna/dnassdna ssdna rnarnaohoh三、用途一、单链核酸酶（一、单链核酸酶（s1/ bal31 nuclease) ) 带切口的双链带切口的双链dnadnadna

14、dna修饰酶修饰酶2.bal312.bal31单链核酸酶的用途单链核酸酶的用途 2.1 dna2.1 dna的缺失突变的缺失突变(bal31)(bal31) bal31 bal31单链核酸酶具有单链核酸内切酶和双单链核酸酶具有单链核酸内切酶和双链链dnadna的的3 3、5 5末端同时降解的活性。末端同时降解的活性。 5pp53hooh3末端转移酶末端转移酶1.1.来源：来源： 又称脱氧核苷酸转移酶，自牛胸腺中分离。 2.2.活性：活性： 催化dntp掺入dna 3-oh末端，形成同聚物末端；反应不需模板dna，需co2+。ssdna 3ssdna 3-oh-oh加尾加尾 dsdna 3dsd

15、na 3-oh-oh加尾加尾( (包括平末端加尾包括平末端加尾) ) 5 5 aacc-oh aacc-oh5 5 aacc aacctttttttt转移酶转移酶 mg mg +、dttpdttp5 5 aacc-oh aacc-oh3 3 ttgg ttgg5 5 aacc aacctttttttt3 3 ttgg ttgg转移酶转移酶 co co 、dttpdttp3.3.用途用途: : 载体和载体和dnadna加上同聚加上同聚“尾巴尾巴”以形成粘性末以形成粘性末端端dna 3dna 3-oh-oh端同位素标记端同位素标记 三、碱性磷酸酶与磷酸激酶三、碱性磷酸酶与磷酸激酶t4 dnat4 dna连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶内切酶内切酶 外源基因外源基因 磷酸激酶磷酸激酶加磷酸基加磷酸基 p pohohohohohohohohohohohohohohohohp pp pp pvectorohohohohohoh ohoh牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶（ciap） alkaline phospha