细胞培养正常组织细胞的培养PPT课件

1、1主要内容主要内容 培养细胞的取材培养细胞的取材 组织材料的分离组织材料的分离 原代细胞培养原代细胞培养 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 建立细胞系建立细胞系第1页/共55页2培养细胞的取材培养细胞的取材 取材的基本要求取材的基本要求 新鲜标本新鲜标本 严格无菌操作严格无菌操作 尽可能减少对细胞的机械损伤尽可能减少对细胞的机械损伤 尽量去除血液、剔除脂肪、结缔组织等尽量去除血液、剔除脂肪、结缔组织等 同时保留组织学标本（光镜和电镜）同时保留组织学标本（光镜和电镜）第2页/共55页培养细胞的取材培养细胞的取材 基本器材和用品基本器材和用品 手术器械手术器械 青霉素小瓶（含培基或缓冲液）

2、青霉素小瓶（含培基或缓冲液） 小烧杯小烧杯 培养皿培养皿第3页/共55页4培养细胞的取材培养细胞的取材 皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材 血细胞取材血细胞取材 骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材 其他组织的取材其他组织的取材第4页/共55页培养细胞的取材培养细胞的取材 皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材 上皮细胞的来源上皮细胞的来源 方法似外科断层皮片手术方法似外科断层皮片手术 面积一般面积一般2-3mm2-3mm2 2，取材尽量薄，取材尽量薄 可用高浓度抗生素漂洗可用高浓度抗生素漂洗人类角质形成细胞人类角质形成细胞第5页/共55页

3、6培养细胞的取材培养细胞的取材 内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材 常用的细胞培养材料常用的细胞培养材料 内脏除肠道外多无菌内脏除肠道外多无菌 实体瘤因破溃、感染可能伴有细菌实体瘤因破溃、感染可能伴有细菌第6页/共55页7培养细胞的取材培养细胞的取材 血细胞取材血细胞取材 染色体分析染色体分析 淋巴细胞体外激活，进行免疫治疗淋巴细胞体外激活，进行免疫治疗v 骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材无需特别处理，离心后直接接种第7页/共55页8主要内容主要内容 培养细胞的取材培养细胞的取材 组织材料的分离组织材料的分离 原代细胞培养原代细胞培养 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 建立细胞系建立细

4、胞系第8页/共55页组织材料的分离组织材料的分离 机械法机械法 化学法化学法第9页/共55页组织材料的分离组织材料的分离 细胞悬液的分离细胞悬液的分离 低速离心低速离心 500-1000rpm 500-1000rpm 10 min10 min第10页/共55页11组织材料的分离组织材料的分离 组织块的分离组织块的分离 机械分散法机械分散法 机械分散法机械分散法 注射器针芯挤压注射器针芯挤压 不锈钢滤网不锈钢滤网 剪切分离法剪切分离法第11页/共55页12组织材料的分离组织材料的分离 组织块的分离组织块的分离机机械械分分散散法法第12页/共55页13组织材料的分离组织材料的分离 组织块的分离组织

5、块的分离 消化分离法消化分离法 胰蛋白酶胰蛋白酶 适合胚胎、上皮、肝、肾等组织消化。适合胚胎、上皮、肝、肾等组织消化。 pH pH、温度、酶蛋白浓度、组织块大小影响消化效果。、温度、酶蛋白浓度、组织块大小影响消化效果。 浓度为浓度为0.10.10.50.5，pH 8.0.pH 8.0. 与与EDTAEDTA混合使用。混合使用。第13页/共55页14组织材料的分离组织材料的分离 组织块的分离组织块的分离 消化分离法消化分离法 胶原酶胶原酶 分为分为、四种类型。四种类型。 根据分离组织类型选择相应型的胶原酶。根据分离组织类型选择相应型的胶原酶。 对胶原有较强的消化作用，适合消化纤维性组织、上皮和癌

6、对胶原有较强的消化作用，适合消化纤维性组织、上皮和癌组织。组织。 浓度为浓度为0.030.030.30.3。第14页/共55页15主要内容主要内容 培养细胞的取材培养细胞的取材 组织材料的分离组织材料的分离 原代细胞培养原代细胞培养 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 建立细胞系建立细胞系第15页/共55页16原代细胞培养原代细胞培养 原代培养原代培养 定义：是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。定义：是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。 优点：生物特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性。优点：生物特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性。第16页/共55页原代细

7、胞培养原代细胞培养 培养方法培养方法 组织块法组织块法 消化法消化法第17页/共55页18原代细胞培养原代细胞培养 可能遇到的问题可能遇到的问题 完全无细胞游出或移动；完全无细胞游出或移动； 有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代；代； 有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；第18页/共55页19原代细胞培养原代细胞培养 可能遇到的问题可能遇到的问题 传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈

8、旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。成稳定生长的肿瘤传代细胞系。 第19页/共55页20原代细胞培养原代细胞培养 问题的解决方法问题的解决方法 加入适宜底物加入适宜底物 把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。等。第20页/共55页21原代细胞培养原代细胞培养 问题的解决方法问题的解决方法 加入生长因子加入生长因子 应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、根据细胞

9、种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。雌激素以及其它生长因子。第21页/共55页22主要内容主要内容 培养细胞的取材培养细胞的取材 组织材料的分离组织材料的分离 原代细胞培养原代细胞培养 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 建立细胞系建立细胞系第22页/共55页 表皮细胞表皮细胞 在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质，因此体外在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质，因此体外培养培养需要使用某些基质、培养液及包括滋养层在内的一些添加物。培养培养需要使用某些基质、培养液及

10、包括滋养层在内的一些添加物。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例第23页/共55页 无菌切取皮肤标本，用无菌切取皮肤标本，用DBSSDBSS冲洗冲洗3 35 5遍。遍。 将标本的上皮层面朝下放入干燥的培养皿中，加数滴将标本的上皮层面朝下放入干燥的培养皿中，加数滴PBSPBS使之湿润，用弯剪尽使之湿润，用弯剪尽可能除净皮下脂肪和结缔组织，将标本切成大约可能除净皮下脂肪和结缔组织，将标本切成大约1cmX2cm1cmX2cm的小块。的小块。 用无用无Ca2+Ca2+、Mg2Mg2+ +的的PBS PBS 冲洗标本至少冲洗标本至少3 3次，将标本放入胰蛋白酶溶液中或中性次，将标本放入胰蛋白酶溶液中

11、或中性分散酶分散酶IIII中，中，44放置放置15-48h15-48h，或，或37 1-3h37 1-3h。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例第24页/共55页几种细胞培养方法举例 表皮层和真皮层分离时表皮层和真皮层分离时,表皮层为棕色，真皮层为白色，观察到表皮与真皮分离时将其一如到另一表皮层为棕色，真皮层为白色，观察到表皮与真皮分离时将其一如到另一10cm塑料平皿，真皮向下，用塑料平皿，真皮向下，用5ml血清完全培养液冲洗，用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入含血清完全培养液冲洗，用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入含20ml培养培养液的液的50ml离心管中，反复吹打，过离心管中，反复吹打，过100目尼龙

12、筛，使角化上皮细胞分离。目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。第25页/共55页 滋养层细胞制备滋养层细胞制备 在已形成单层的在已形成单层的3T33T3细胞培养瓶中加入丝裂霉素，使细胞培养瓶中加入丝裂霉素，使3T33T3细胞不在分裂增殖，即可作为表皮细胞的黏附细胞不在分裂增殖，即可作为表皮细胞的黏附滋养细胞。滋养细胞。 黏壁剂包被黏壁剂包被 用用0.01%0.01%的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，过夜，弃上清，的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，过夜，弃上清，4040烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫外线照烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫外线照射射2h2h消毒备用。消毒备用。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例第26页

13、/共55页27几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞 取健康产妇分娩正常新生儿后取健康产妇分娩正常新生儿后6 6小时以内的脐带，立即浸泡在含青霉素、小时以内的脐带，立即浸泡在含青霉素、链霉素的链霉素的D-HanksD-Hanks液中，洗去外部血污。在超静工作台上剪去有钳子夹痕、液中，洗去外部血污。在超静工作台上剪去有钳子夹痕、扭曲、凝血块、穿孔段后分离出扭曲、凝血块、穿孔段后分离出10-1510-15厘米一段。厘米一段。第27页/共55页28几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞 用注射器吸取用注射器吸取 Hank

14、sHanks液，充分清洗脐静脉，用血管钳夹紧脐带一端，从液，充分清洗脐静脉，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉管腔内缓慢注入另一端向脐静脉管腔内缓慢注入0.10.1I I型胶原酶型胶原酶8-10ml8-10ml，静脉充盈后，静脉充盈后，用另一只血管钳夹住防胶原酶返流。置入用另一只血管钳夹住防胶原酶返流。置入3737培养箱内消化培养箱内消化1010分钟。分钟。第28页/共55页 以以1 15X105X105 5个细胞的密度接种在适量个细胞的密度接种在适量DMEMDMEM或或FADFAD培养液培养液中，中，3737培养培养1-31-3天，细胞贴壁后，冲洗未贴壁细胞。天，细胞贴壁后，冲洗未贴壁细

15、胞。 传代培养：传代培养：0.05%-0.1%0.05%-0.1%的的EDTAEDTA孵育孵育10-30min10-30min，细胞变，细胞变圆后，在用圆后，在用0.1%0.1%的胰蛋白酶和的胰蛋白酶和0.05%EDTA0.05%EDTA消化，吸管吹消化，吸管吹打是细胞完全脱壁。打是细胞完全脱壁。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例第29页/共55页30几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞 松开一端血管钳，将含有内皮细胞的消化液收集到离心管中，然后注入含松开一端血管钳，将含有内皮细胞的消化液收集到离心管中，然后注入含1010胎牛血清的胎牛血清的RP

16、MI1640RPMI1640培基终止消化并冲洗血管，以便获取更多的内培基终止消化并冲洗血管，以便获取更多的内皮细胞。皮细胞。第30页/共55页31几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞 将冲洗液一并注入离心管，以将冲洗液一并注入离心管，以1000 rpm1000 rpm离心离心 l0l0分钟，弃上清液，加分钟，弃上清液，加RPMI RPMI 16401640培养液，接种于培养液，接种于50ml50ml一次性塑料培养瓶中，置一次性塑料培养瓶中，置3737培养箱内，在培养箱内，在5 5C0C02 2 24 24小时后换液一次，除去红细胞和未贴壁的细胞继续培养

17、，隔两天换小时后换液一次，除去红细胞和未贴壁的细胞继续培养，隔两天换液一次。液一次。第31页/共55页32几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞第32页/共55页33几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞第33页/共55页34几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞人滑膜细胞 将手术取下的新鲜的滑膜组织置于无菌的平皿中，剔除脂肪组织，用含青、将手术取下的新鲜的滑膜组织置于无菌的平皿中，剔除脂肪组织，用含青、链霉素的链霉素的D-HanksD-Hanks洗涤两次，用眼科剪将滑膜组织充分剪碎，吸入螺口管洗涤两

18、次，用眼科剪将滑膜组织充分剪碎，吸入螺口管中，中，1200rpm/min1200rpm/min，离心，离心1010分钟。分钟。第34页/共55页35几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞人滑膜细胞 离心后，弃上清，加入一倍体积的离心后，弃上清，加入一倍体积的0.40.4IIII型胶原酶，置于型胶原酶，置于37 537 5CO2CO2培养箱中消化培养箱中消化6060分钟（每分钟（每1515分钟吹打一次）。初次消化后，离心弃上清，分钟吹打一次）。初次消化后，离心弃上清，再加入一倍体积的再加入一倍体积的0.250.25胰蛋白酶继续消化胰蛋白酶继续消化3030分钟。最后加入含分钟。最后加

19、入含1515血血清的清的RPMI1640RPMI1640培养液终止消化。培养液终止消化。第35页/共55页36几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞人滑膜细胞 消化后的细胞悬液经消化后的细胞悬液经200200目的筛网过滤并离心洗涤两次，再用含目的筛网过滤并离心洗涤两次，再用含1010小小牛血清的牛血清的RPMI1640RPMI1640培养液重悬细胞，接种于培养瓶中，置于培养液重悬细胞，接种于培养瓶中，置于375375CO2CO2培养箱中培养培养箱中培养2424小时，轻轻去除仍悬浮的细胞，继续培养，每小时，轻轻去除仍悬浮的细胞，继续培养，每3 3天换液一天换液一次次, ,约约101

20、0天左右可长满瓶底。天左右可长满瓶底。第36页/共55页37几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞人滑膜细胞 细胞长满培养瓶后即可进行传代培养，用细胞长满培养瓶后即可进行传代培养，用0.050.05胰蛋白酶胰蛋白酶-0.02-0.02EDTAEDTA消化后按几种细胞培养方法举例消化后按几种细胞培养方法举例第37页/共55页38几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞第38页/共55页39几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 人滑膜细胞人滑膜细胞第39页/共55页40几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 乳鼠心肌细胞 分步消化法第40页/共55页 对于股骨中骨髓

21、细胞的分离，则可以采取对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股骨腔冲洗股骨腔的的方法获得。方法获得。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例第41页/共55页实验材料实验材料 小鼠小鼠小鼠的抓法：小鼠的抓法： 从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。盘上或报纸上。第42页/共55页小鼠的处死：颈椎脱位法右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。第43页/共55页

22、股骨骨髓细胞悬液的制备股骨骨髓细胞悬液的制备 冲洗骨髓腔冲洗骨髓腔 ： 用剪刀剪开股骨的用剪刀剪开股骨的一端一端，将注射器针头插，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的另另一端一端，用，用D-HanksD-Hanks液多次冲洗骨髓腔，收液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中集细胞悬液于离心管中。 第44页/共55页45主要内容主要内容 培养细胞的取材培养细胞的取材 组织材料的分离组织材料的分离 原代细胞培养原代细胞培养 几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例 建立细胞系建立细胞系第45页/共55页46建立细胞系建立细胞系 细胞系 初代培养物开始第

23、一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。第46页/共55页47建立细胞系建立细胞系 细胞系细胞系 无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。 无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接

24、种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。 第47页/共55页48建立细胞系建立细胞系 细胞株细胞株（Cell strainCell strain） 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。 由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。第48页/共55页49建立细胞系建立细胞系 ATCCATCC American Type Culture CollectionAmerican Type Culture Collection 美国标准菌库美国标准菌库第49页/共55页50建立细胞系建立细胞系 细胞入库检测项目细胞入库检测项目 组织来源和已传代数：应说明细胞供体所属物种，来自人或动物，个人性组织来源和已传代数：应说明细胞供体所属物种，来自人或动物，个人性别、年龄、取材的器官和组织。肿瘤组织应说明临床和病理诊断及病历号别、年龄、取