实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定

1、实验十 蛋白质的表达、分离纯化和鉴定第一部分 蛋白质的表达、分离纯化目的要求（1）了解重组蛋白表达的方法和意义。（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。实验原理目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37，IPTG诱导下，超量表达携

2、带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。试剂和器材一、 试剂1 LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。2 氨苄青霉素：100mg/mL。3 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM -巯基乙醇, pH8.0。4 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4

3、, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。5 洗脱液缓冲液： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。6 IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（1´10 cm），蠕动泵操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL LB液体培养基中 （含100g/mL 氨苄青霉素），37震荡培养过夜。2. 转接1-5mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37震荡培养至OD600 = 0.6 -

4、0.8。取1ml 培养物用于SDS-PAGE 分析。3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L, 37继续培养1-3h.。4. 12,000rpm 离心5 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20或-70冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化1. Ni2+层析柱的准备：在层析柱中加入1mL Ni2+介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液（GLB）洗涤。2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，用振荡器轻柔的混匀样品60min, 4或室温 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10l 上

5、清样品用于SDS-PAGE 分析。3. 上清样品以10-15mL/h 流速流经Ni2+层析柱，收集流出液，取10l样品用于SDS-PAGE 分析。4. 洗脱杂蛋白：用清洗缓冲液（UWB）50mL以10-15mL/h流速洗涤层析柱，去除杂蛋白，直至OD280 = 0.01，约3-4h，取10l洗涤结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。5. 洗脱目标蛋白：用洗脱液缓冲液10mL洗柱，每管1 mL分部收集洗脱液，共收集6-10管，分别取10l样品用于SDS-PAGE 分析。第二部分 蛋白质的鉴定 目的要求（1）了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理。（2）掌握凝胶电泳实验操作规程。实验原理电泳可用

6、于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。但如果加入某种试剂使电荷因素消除，则电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。十二烷基硫酸钠（SDS）就具有这种作用。在蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，蛋白质SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小

7、，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括积层胶和分离胶两部分。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分离。试剂和器材一、试剂1 30AcrBis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至10

8、0mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。2 Tris-HCl/SDS，pH 6.8：在40mL水里加入6.05g Tris， 0.4g SDS, 用1M HCl调pH至6.8， 补水至100mL。3 Tris-HCl/SDS，pH 8.8：在300mL水里加入，91g Tris， 2g SDS, 用1M HCl调pH至8.8， 补水至500mL。4 10% 过硫酸铵（现用现配）5 TEMED（商品试剂）6 2×上样缓冲液：在40mL水里加入，1.52g Tris， 20mL甘油， 2.0g SDS， 2.0mL 2-巯基乙醇，1mg溴酚蓝，用1M HCl调pH至6.8，加水至100

9、mL7 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱，94g甘氨酸（电泳级），50mL 10% SDS, 配至1000mL.8 考马斯亮蓝染液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇：水（1：1）和10mL冰乙酸的混合液中。9 脱色液：水：乙酸：乙醇 = 6.7：0.8：2.5二、器材垂直板电泳槽,脱色摇床， 移液管（1，5，10mL），烧杯（25，50，100mL），细长头的吸管，微量注射器（10µL或者50µL）。操作方法一、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配置：1. 安装玻璃板，检查漏液情况。2. 制备分离胶：按表1分离胶所示，依次在试管中混合各成分，

10、一旦加入TEMED后，凝胶马上开始聚合，故应立即快速混匀，迅速在两玻板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，注意流出浓缩胶所需空间。并在其上覆盖一层水或异丁醇溶液。将凝胶垂直放置于室温下。1. 分离胶聚合后（约30min），倒出覆盖层液体，用枪将残留液体吸净。2. 制备浓缩胶：按表1浓缩胶所示，依次在试管中混合各成分，一旦加入TEMED后，应立即快速悬动混合物，迅速在分离胶上灌注浓缩胶溶液，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的电泳梳，小心避免混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下。分离胶水30%丙烯酰胺 Tris缓冲液（PH8.8）10%过硫酸铵TEMED4mL5mL3mL120l20l浓缩胶水30%丙烯酰胺 Tri

11、s缓冲液（PH6.8）10%过硫酸铵TEMED1.8mL0.4mL0.75mL60l15l二 、上样样品的处理：将样品置于1×上样缓冲液中，在100加热5min使蛋白质变性。加热后8000rpm离心1min.三、 电泳：1. 浓缩胶聚合完全后（约30min），将凝胶固定于电泳装置上，并加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，然后小心移出电泳梳。2. 按预定顺序加样，小心缓慢加入样品，每样品加12l。3. 将电泳与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm,当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约1h），然后关闭电源。4. 将玻璃板从电泳装置上卸下，并将凝胶取出，在第一点样孔侧的凝胶上切去一角以标注凝胶的方位