细胞凋亡月PPT课件

1、概述概述细胞凋亡的调控细胞凋亡的调控细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测第1页/共67页 概述概述第2页/共67页apoptosis第3页/共67页第4页/共67页细胞坏死与细胞凋亡的区别细胞坏死与细胞凋亡的区别第5页/共67页 细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别特征特征 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死诱导因素诱导因素 生理及弱刺激生理及弱刺激 强烈刺激强烈刺激受累范围受累范围 单个细胞单个细胞 多个细胞多个细胞膜完整性膜完整性 保持到晚期保持到晚期 早期即丧失早期即丧失细胞体积细胞体积 减小、固缩减小、固缩 增大肿胀增大肿胀染色质染色质 凝聚成半月形凝聚

2、成半月形 稀疏成网状稀疏成网状细胞器细胞器 无明显变化无明显变化 肿胀破坏肿胀破坏溶酶体溶酶体 保持完整保持完整 破坏外溢破坏外溢细胞形状细胞形状 形成凋亡小体形成凋亡小体 破裂成碎片破裂成碎片炎症反应炎症反应 凋亡小体被吞噬凋亡小体被吞噬 有有 DNADNA分解机制分解机制 核小体间解离核小体间解离 随机降解随机降解 基因活化基因活化 ATPATP减少减少 （新蛋白质合成）（新蛋白质合成） 核酸内切酶激活核酸内切酶激活 膜损害、自由基损害膜损害、自由基损害第6页/共67页 第7页/共67页凋亡过多或不足疾病： 肿瘤 艾滋病 缺血性损伤（心肌梗死、脑卒中） 病毒感染第8页/共67页 二二 、凋

3、亡时细胞的主要变化、凋亡时细胞的主要变化1. 形态学改变形态学改变 （The morphologic characteristics of apoptosis）第9页/共67页细细 胞胞 凋凋 亡亡第10页/共67页(扫描电镜)正常细胞(扫描电镜) (透射电镜) 凋亡细胞凋亡小体第11页/共67页第12页/共67页第13页/共67页 第14页/共67页细胞凋亡的调控细胞凋亡的调控 凋亡相关因素凋亡相关因素 凋亡的过程及机制凋亡的过程及机制 凋亡相关基因凋亡相关基因第15页/共67页第16页/共67页凋亡诱导因素凋亡诱导因素死亡信号死亡信号凋亡相关基因激活凋亡相关基因激活 激活激活激活激活凋亡的

4、启动凋亡的启动 凋亡的执行凋亡的执行 第17页/共67页细胞凋亡信号转导的一般特征：细胞凋亡信号转导的一般特征： 信号转导系统具有多样性 细胞凋亡与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统存在部分共同的通道 细胞内同一信号激活的多条途径存在互通的交叉点第18页/共67页凋亡的起始阶段：凋亡的起始阶段： 膜受体（死亡受体）途径膜受体（死亡受体）途径 线粒体途径线粒体途径第19页/共67页 死亡受体死亡受体（death receptor, DR） 肿瘤坏死因子受体超家族成员，跨膜蛋白，与相应配体结合传递细胞信号 Fas(CD95), TNFR1死亡受体途径死亡受体途径第20页/共67页 参与死亡受体信号

5、转导的接头蛋白： 死亡结构域死亡结构域（ death domain, DD）蛋白蛋白 FADD：Fas相关死亡结构域 FasL + Fas +FADD 细胞凋亡 第21页/共67页 FADD的C端与Fas胞内段结合， N端与caspase8酶原交联第22页/共67页（2 2）线粒体途径）线粒体途径线粒体释放细胞色素C 细胞凋亡 PT孔开放线粒体跨膜电位，细胞色素C释放 促凋亡蛋白Bax促PT孔开放 抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl抑制PT孔开放第23页/共67页 细胞色素C + Apaf-1 + caspase9前体凋亡体 召集并激活caspase3 细胞凋亡 Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因

6、子第24页/共67页线粒体途径线粒体途径+caspase-independent apoptosisBid第25页/共67页凋亡的执行凋亡的执行Caspase依赖的细胞凋亡依赖的细胞凋亡( (C Cysteineysteine，aspaspartic acidartic acid，proteproteasease) ) Caspase 的特点： 以酶原的形式存在，激活后水解形成大小 两个亚单位 第26页/共67页大小亚基结合（二聚体） caspase活（四聚体） Pro-caspase： NH2末端结构域 、20KD亚基、 10KD亚基 剪切第27页/共67页第28页/共67页Caspase家

7、族的分类 凋亡启动亚类凋亡启动亚类Caspase蛋白酶蛋白酶： Caspase8， Caspase 9，Caspase10 在凋亡启动阶段发挥作用 凋亡效应亚类凋亡效应亚类Caspase蛋白酶蛋白酶： Caspase3， Caspase6， Caspase7 在凋亡执行阶段发挥作用第29页/共67页 水解粘附分子，使细胞与周围组织脱离 活化DNA酶，使DNA片段化 水解DNA多聚酶，抑制核酸合成 降解Rb蛋白，使细胞周期停滞 剪切细胞内结构蛋白 Caspase的作用第30页/共67页第31页/共67页 正常情况下， CAD (caspase-activated DNase)与抑制物ICAD-D

8、FF-45结合，存在于胞质中，无活性CaspaseCaspase活化后降解活化后降解ICADICAD， CAD激活并入核降解DNA使其片段化 活化的CAD 在核小体的连接区将DNA切断，形成约200bp整倍数的核酸片段第32页/共67页Caspase-independent apoptosis） 第33页/共67页激活核转录因子，加速凋亡相关基因的转录在ATP参与下暴露出核小体间连接区，有利于核酸内切酶切割DNA激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链激活谷氨酰胺转移酶，使细胞骨架分解凋亡小体细胞凋亡第34页/共67页3、细胞凋亡的调控基因、细胞凋亡的调控基因 （Regulated

9、 mechanism of apoptosis）第35页/共67页 Bcl-2Bcl-2基因基因 （B cell lymphoma/leukemia-2B cell lymphoma/leukemia-2） 广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞 Bcl-2家族已发现15个成员，可分为3个亚族： Bcl-2Bcl-2亚家族亚家族：抑制细胞凋亡 BaxBax亚家族：亚家族：促进细胞凋亡 BH3BH3亚家族：亚家族：促进细胞凋亡第36页/共67页Bcl-2Bcl-2蛋白抑制凋亡的机制：蛋白抑制凋亡的机制：维持细胞钙稳态第37页/共67页促凋亡基因（Bax, Bak, Bid,

10、 Bim, Bad) 其蛋白与抗凋亡蛋白相互作用，使抗凋亡蛋白抑制凋亡的作用丧失，引发线粒体膜崩解第38页/共67页 p53促凋亡机制：促凋亡机制：第39页/共67页第40页/共67页第41页/共67页第42页/共67页第43页/共67页第44页/共67页 第45页/共67页细胞凋亡在疾病防治中的意义细胞凋亡在疾病防治中的意义 合理利用凋亡相关因素合理利用凋亡相关因素1.1.诱导靶细胞凋亡诱导靶细胞凋亡 放疗、化疗放疗、化疗 高热、高温高热、高温2.2.减少细胞凋亡减少细胞凋亡 ： NGFNGF、促生长因子、抗氧化剂、促生长因子、抗氧化剂抑制抑制Bcl-2Bcl-2抗凋亡作用抗凋亡作用增强促凋

11、亡基因作用增强促凋亡基因作用增强增强P53P53促凋亡作用促凋亡作用第46页/共67页 干预凋亡信号转导干预凋亡信号转导 调节凋亡相关基因调节凋亡相关基因 控制凋亡相关酶学机制控制凋亡相关酶学机制 防止线粒体跨膜电位的下降防止线粒体跨膜电位的下降第47页/共67页 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 早期检测早期检测 1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） 2 2、线粒体膜势能（、线粒体膜势能（mtmt）的检测）的检测 3 3、细胞色素、细胞色素C C的定位检测的定位检测 4 4、Caspase-3Caspase-3活性的检测活性的检测 5 5

12、、细胞内氧化还原状态改变的检测、细胞内氧化还原状态改变的检测 6 6、凋亡相关蛋白、凋亡相关蛋白TFAR19TFAR19的表达和细胞定位分析的表达和细胞定位分析 第48页/共67页晚期检测晚期检测1 1、DNADNA片断化检测片断化检测2 2、TUNELTUNEL法法3 3、细胞凋亡的形态学检测、细胞凋亡的形态学检测第49页/共67页 磷脂酰丝氨酸外翻分析（磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） Phosphatidylserine(PS) Phosphatidylserine(PS) 正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期从细胞膜的内侧翻转到膜表面 Annexin-VA

13、nnexin-V： Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）标记后作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。第50页/共67页第51页/共67页第52页/共67页Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV + PI第53页/共67页第54页/共67页 流式细胞术检测：流式细胞术检测：第55页/共67页 线粒体膜势能（线粒体膜势能（mtmt）的检测）的检测 线粒体荧光染料线粒体荧光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）

14、、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电位的增高或降低。第56页/共67页 Caspase3 Caspase3 活性检测活性检测第57页/共67页 凋亡相关蛋白凋亡相关蛋白TFAR19TFAR19蛋白的表达蛋白的表达 和细胞定位分析和细胞定位分析 凋亡早期TFAR19表达并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。 利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针进行TFAR19蛋白的细胞定位分析 第58页/共67页Double staining analysis of nuclear localizati

15、on ofTFAR19 in K562 andHeLa cells treated with VP16第59页/共67页 DNA DNA片段化分析片段化分析 细胞凋亡时染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。第60页/共67页 TUNEL法法第61页/共67页 TUNEL法法第62页/共67页第63页/共67页 细胞凋亡的形态学检测细胞凋亡的形态学检测 光学显微镜和倒置显微镜 未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO ,Hoech