朊病毒及其检测PPT课件

1、CONTENTS一、前言一、前言二、二、PrPC与与PrPSC三、三、PrPC的功能的功能四、朊病毒的致病机理四、朊病毒的致病机理五、五、朊病毒的检测朊病毒的检测六、六、问题问题与展望与展望第1页/共42页一、前言第2页/共42页1引言 传染性海绵状脑病(transmissible spongi-form encephalopathy, TSE)是一类致死性的神经系统退行性疾病。在哺乳动物中常见疯牛病、羊瘙痒症、猫海绵状脑病以及传染性水貂脑软化病等；在人身上则发现了库鲁病、致死性家族失眠症、克-雅氏病以及格斯特曼综合症等。患病的人和动物，大脑皮层的神经元细胞会发生进行性空泡化, 星形胶质细胞不

2、断增生, 造成灰质变薄而白质相对明显,最后变成海绵状态。第3页/共42页（左）病羊神经组织的海绵状损伤。（右）病人大脑组织切片，海绵状病变及周围的沉淀斑第4页/共42页2朊病毒的发现英国的牧人就注意到羊的一种致死性疾病。 M. fadyian 提出该病是由寄生虫引起的。Cuille 等发现瘙痒因子有传染性，用滤膜过滤后仍具有传染性，而提出该因子是一种病毒。Gajdusek 证实了CJD 的传染性，并根Scrapie 、Kuru、CJD3种疾病的共同特征提出了传染性海绵状脑病(TSE) 这一概念。美国生物化学家Prusiner证明并提出羊瘙痒病的病原体是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，称为蛋白

3、质侵染因子(proteinaceous infectious particle，简称prion)。第5页/共42页3朊病毒引起的人类疾病第6页/共42页4朊病毒引起的人类疾病 疾病疾病症状症状脑组织变化脑组织变化羊瘙痒症患病羊倾向蹭掉他们的毛，其他症状诸如：行走困难、行动丧失协调性。牛海绵状脑病(BSE)多数病牛行为反常、烦躁不安、对声音和触摸过敏，两耳对称活动困难，心搏缓慢，呼吸缓慢，体重下降，极度消瘦。病牛脑灰质部分形成海绵状空泡，脑干灰质两侧呈对称病变，神经纤维网有卵形和球形空洞，神经细胞肿胀层气球状。可传染性貂脑病(TME)初期一般表现为食欲不振、日渐消瘦和衰弱，皮毛变粗，且随着疾病的

4、发展，动物将静进性变得兴奋；严重时快速转圈，禁不住咬尾和紧闭下巴；临死前变得嗜睡。尸检可见脱水和消瘦，脑皮质和皮质下广泛的海绵状变性并伴有神经胶质星状细胞增生。慢性消瘦病(CWD)慢性消瘦，体重减轻；大多数表现为逐渐减少与其他动物的接触，倦怠，面无表情且反复以一定的模式行走；饮水和尿量增多。第7页/共42页5疾病来源人类prion病约有15%的患者具有遗传性，即为家族性疾病，为常染色体显性遗传，因编码PrP的基因突变所致。遗传性由食用疯牛病病牛及其他染病动物所致。食源性传播目前已报道全世界因医源性传染而引起的prion病已达160多例，而且，输血及血制品是否也能传播此病，已引起人们的关注。医源

5、性感染第8页/共42页6致病特点2一旦发病，呈慢性、进行性发展，以死亡告终；5患者以痴呆、共济失调、震颤等为主要临床表现。4无抗原性，不能诱导产生特异性免疫应答；1潜伏期长，可达数月至数年甚至数十年；3病理学特征是大脑皮质神经元空泡变性、死亡、缺失，而星形胶质细胞高度增生，故大脑皮质疏松呈海绵状：有淀粉样斑块形成，HE染色淡红脑组织中无炎症反应：无淋巴细胞和炎症细胞浸润；第9页/共42页二、PrPC与PrPSC第10页/共42页 第11页/共42页朊病毒蛋白(Prion Protein)，简称为PrP。PrPC是指一般情况下，正常宿主细胞基因编码产生的朊蛋白，无致病性，是一种糖基磷脂酞肌醇(C

6、PI)修饰膜在糖蛋自。广泛表达于脊椎动物，它与神经系统功能的维持、淋巴细胞信号转导、核酸代谢等有关。PrPC当其发生构象改变后可变成致病性朊病毒(PrPsc)，PrPsc可引起包括疯牛病在内的一系列致死性神经性疾病。相对分子质量为2730KD，故又称作PrP2730。PrPSC1PrPC与PrPSC第12页/共42页PrPc PrPSc螺旋折叠 二者是异构体,由同一染色体基因PRNP编码，其氨基酸序列完全一致,根本差别在于它们构象上的差异，PrPC分子中含42%的螺旋，折叠仅为3 %，而PrPSC的折叠高达43 %，螺旋为30 %。故一般认为，PrPSC是由于PrPC发生蛋白质错误折叠，一些螺

7、旋变构为折叠，三维构象发生变化而产生的，同时带来一系列理化性质的变化。2PrPC与PrPSC的结构第13页/共42页3PrPC与PrPSC的理化性质第14页/共42页4PrPC向PrPSC的转化第15页/共42页（PrPSc的累积）（PrP转化为PrPSc)(PrP与PrPSc之间反应)（PrPc内生）模型一 ：该模型是假定一个单一的PrPSC分子与一个单一的PrPC分子结合并催化其转化成PrPSC。这两个PrPSC分子,可以继续转换成PrPC。第16页/共42页(伸长)（构象变化)(破碎成多个部分)（感染）模型二：假设PrPSC只是纤维，捆绑PrPC fibril，然后将其转化成PrPSC，

8、形成更长的纤维，这一现象可在染病毒致病中观察到。第17页/共42页三、PrPC的功能第18页/共42页核酸代谢抗氧化参与神经系统Cu2+代谢维持神经系统功能信号转导细胞调亡PrPC的功能第19页/共42页1维持神经系统功能 在所有细胞类型中,以神经元表达PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突触处(终板处也有富集)，这提示PrPC对神经系统有特殊的重要性。PrPC除实验表明，PrPC缺失虽不引起肉眼可见的行为和发育障碍，但在整体动物水平来看可导致与昼夜节律有关的行为异常。在神经系统水平，PrPC缺失可导致电生理参数方面的改变。第20页/共42页 有证据表明，在出现进行性运动失调症状PrPC缺失

9、小鼠中，发现脑部严重萎缩，蒲肯野细胞异常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野细胞过度兴奋而导致小鼠死亡。 PrPC缺陷鼠还表现出对外源性铜和过氧化氢等应激诱导剂应答方面的改变。 在细胞水平，PrPC缺陷鼠的神经元在培养时存活能力下降，且对铜和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所导致的氧化损伤和毒性的敏感性增加； 星形胶质细胞在摄取谷氨酸方面有异常； 小胶质细胞对兴奋物质的反应性下降；在突触形成中有结构改变。由此可见，PrPC可能在一定程度上参与神经系统功能的维持。第21页/共42页2参与神经组织的Cu2+代谢 PrPC作为脑组织中膜在铜结合蛋自参与神经组织中Cu2+的稳态平衡调节，当转变为PrPSC就失去结

10、合Cu2+的能力，造成神经组织中Cu2+含量异常，导致神经细胞损伤。 Cu2+对不同神经细胞PrPC的影响也不相同。第22页/共42页3抗氧化 PrPC通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性。PrPC借其八肽重复区最多可结合4个铜原子。结合后形成的复合物具有抗氧化活性，从而保护细胞免受氧化损伤。第23页/共42页4参与淋巴细胞信号转导 PrPC可高水平地在人T、B淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞中表达，不同细胞中表达PrPC的糖基组成、糖链形状及蛋自酶解的敏感性都有差异。 T细胞的活化伴随着其表而PrPC的表达上调，且PrPC在记忆T细胞比初始T细胞的表达水平高。第24页/共42页5细胞凋亡 在

11、PrP敲除小鼠神经元中，多种凋亡相关蛋自显著增加，线粒体Ca2+含量改变、细胞色素c释放，都表明PrP参与细胞凋亡调控过程。 体外试验也显示PrPC能够保护人的神经元免受Bax诱导的细胞凋亡，而缺失八肽序列或C端带有突变的PrP均不具有该活性。第25页/共42页6核酸代谢 Gabus等根据小鼠中瘟痒病的感染过程会因鼠自血病病毒（MuLV）的复制而加速，以及人类PrP功能上类似于NCp7，可辅助反转录酶合成前病毒DNA等现象，提出PrP可能参与了体内核酸代谢过程。第26页/共42页四、朊病毒的致病机理第27页/共42页致病机理电泳活性染色法阮病毒学说 “yeast prions”学说 第28页/

12、共42页1阮病毒学说 PrPC是一种膜蛋白，其C端含有23个氨基酸组糖基磷酸肌醇(GPI)锚受体结合位点，因此可通过糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitol phosphohptds)联在膜上，定位于细胞膜的穴样内陷类结构域（CLDs），在神经元，当膜浆膜上的PrPC变成为PrPSC后，PrPSC脱落并聚集在神经元的溶酶体。当达到数量，就可使神经元细胞破裂，形成神经组织的空泡化，并使星型胶质细胞增生，第29页/共42页第30页/共42页2“yeast prions”学说 第31页/共42页3蛋白的氧化反应学说 杨池明提出了疯牛病蛋白长寿命自由基即为疯牛病中的亚病毒的理论设想，他认为真正的疯牛病

13、蛋白亚病毒可能是由蛋白的氧化反应所形成的疯牛病蛋白自由基。 应用此理论能够解释疯牛病的一些病理现象。第32页/共42页五、朊病毒的检测第33页/共42页接种传递组织印记法酶联免疫吸附法毛细管凝胶电泳朊病毒的检测第34页/共42页取组织标本 10倍连续稀释研 磨10个稀释浓度分别接种小鼠直到死亡或盲传几代 出现症状杀死，取脑组织检查 死亡不出现症状 观察饲养24h未死亡正常饲养 补接1动物的接种传递实验第35页/共42页取标本甲酚脱毒甲醛固定石蜡包埋 55干燥二甲苯脱蜡 异丙醇水化 空气干燥蛋白酶K消化 盐酸胍处理 1. 前处理2. 检测NC：硝酸纤维素膜 前处理品免疫学检测取出NC膜5-7m薄片收集在NC上2mm厚切片切片55水浴2组织印记法第36页/共42页匀浆离心处理显色 3酶联免疫吸附法第37页/共42页 电泳 4毛细管凝胶电泳免疫测定法第38页/共42页六、展望第39页/共42页高级结构致病原因感染性 如何对非结晶型的朊病如何对非结晶型的朊病毒蛋白进行分子结构的毒蛋白进行分子结构的准确分析，能否寻找一准确分析，能否寻找一种方法，可以获得朊病种方法，可以获得朊病毒蛋白的准确的高级结毒蛋白的准确的高级结构。构。 朊病毒的致病原因是朊病毒的致病原因是PrPsc的过度增殖还的过度增殖还是由于是由于PrPc正常功能正