ALT,AST测定方法

1、3.8.2.1 小鼠肝、肾、心组织alt 含量测定1 实验原理谷丙转氨酶作用于由丙氨酸及 -酮戊二酸组成的基质，在一定的反应条件下，产生一定量的丙酮酸。在酶反应到规定时间时，加入2,4-二硝基苯肼，在当量浓度的酸性条件下，终止了酶反应。2,4-二硝基苯肼分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质 -酮戊二酸形成各自对应的2,4-二硝基苯腙。 在碱性条件下， 虽然二种苯腙分别显出红棕色，但由于丙酮酸生成的颜色较深，以同等克分子计算，在 480-530nm 波长范围内其浓度约为 -酮戊二酸生成的颜色的3 倍，利用这一差别可以反映出丙酮酸的生成量。本实验设谷草转氨酶活力为：样品液与alt基质液在 37下反应

2、 60min 时每生成 1 mol 丙酮酸所需的酶量为1 个活力单位（u） 。2 试剂配制（1）0.1mol/l 磷酸缓冲液（ ph7.4）称取 nah2po4.2h2o 2.96495g ，na2hpo4.12h2o 29.0142g，溶解于蒸馏水中，定容到 1000ml。（2） 20 mol/l 丙酮酸钠标准溶液称取 22mg 丙酮酸钠，溶解于0.1mol/l 磷酸缓冲液（ ph7.4）100ml 中。现配现用。（3）alt 基质液称取 -酮戊二酸 29.2mg， dl-丙氨酸 1.78mg （l-丙氨酸 0.85mg） 溶解于 30ml 0.1mol/l 磷酸缓冲液（ ph7.4）中，溶

3、解后校正 ph 至 7.4，再用 ph7.4 的磷酸缓冲液定容至 100ml，置冰箱中保存备用（可保存一周） 。可加入氯仿数滴防腐。（4）0.02% 2，4二硝基苯肼溶液称取 20mg2，4二硝基苯肼先溶解于10 ml 纯盐酸中，电炉加热助溶，待2，4二硝基苯肼全部溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，过滤后盛于棕色中，置冰箱中保存备用。（5）1mol/l naoh 溶液：称取 4g naoh 溶解于蒸馏水后，定容到100ml。（6）0.4 mol/l naoh 溶液称取 16 g naoh溶解于蒸馏水后，定容到1000ml。3 实验方法（1） 样品的处理按3.5 方法进行。（2）alt 标准曲线

4、的制作1将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内，预温37至然后使用取 6 支试管，按表 4 进行配制表 4 alt 标准曲线的配制试管编号试剂(ml) 0 1 2 3 4 5 20 mol/l 丙酮酸钠标准溶液0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 alt 基质液0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1mol/l 磷酸缓冲液（ ph7.4）0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 混匀，将各管置于37水浴中保温 60min 2,4-二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，将各管置于37水浴中保温 2

5、0min 0.4 mol/l naoh溶液5 5 5 5 5 5 混匀，将各管置于37水浴中保温 10min 2冷却后以 0 为对照用分光光度计比色测定吸光值od520nm。3以丙酮酸含量为纵坐标，吸光值od520nm为横坐标绘制标准曲线 ( 见图 3) 。00.10.20.30.40.50.600.10.20.30.4吸光度丙酮酸含量mol/l图 3 alt 标准曲线见图 3，建立回归方程为：y =1.4149x ( 线性相关系数： r0.9965)其中： x吸光度；y丙酮酸含量 ( mol/l) (3) 小鼠肝、肾、心组织alt 含量测定1将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内，预

6、温至然后使用取2 支试管，按表 5进行配制表 5 alt 含量测定0 1 样品0.10 0.10 alt 基质液- 0.50 混匀，将各管置于37水浴中保温 60min alt 基质液0.50 - 2，4二硝基苯肼0.5 0.5 混匀，将各管置于37水浴中保温 20min 0.4 mol/l naoh 溶液5 5 管号试剂ml 混匀，将各管置于37水浴中保温 10min 2冷却后以 0 为对照用分光光度计比色测定吸光值od520nm。3在标准曲线中读出样品丙酮酸的生成量( 见图 3) 。3.8.2.2 小鼠肝、肾、心组织谷草转氨酶（ast）含量测定1 实验原理ast 作用于门冬氨酸和 -酮戊二

7、酸组成的基质，在一定的反应条件下，产生一定量的草酰乙酸， 草酰乙酸在反应过程中又自行脱羧成为丙酮酸。在酶反应到规定时间时， 加入 2,4-二硝基苯肼， 在当量浓度的酸性条件下， 终止了酶反应。2,4-二硝基苯肼分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质 -酮戊二酸形成各自对应的 2,4-二硝基苯腙。在碱性条件下，虽然二种苯腙分别显出红棕色，但由于丙酮酸生成的颜色较深， 以同等克分子计算， 在 480-530nm波长范围内其浓度约为 -酮戊二酸生成的颜色的3 倍，利用这一差别可以反映出丙酮酸的生成量。本实验设谷草转氨酶活力为：样品液与ast 基质液在 37下反应 60min 时产生的草酰乙酸自行脱羧成为

8、1 mol 丙酮酸所需的酶量为1 个活力单位。2 试剂配制(1) 0.1mol/l 磷酸缓冲液（ ph7.4）称取 nah2po4.2h2o 2.96495g，na2hpo4.12h2o 29.0142g ，溶解于蒸馏水中，定容到 1000ml。(2) 20 mol/l 丙酮酸钠标准溶液称取 22mg 丙酮酸钠，溶解于0.1mol/l 磷酸缓冲液（ ph7.4）100ml 中。现配现用。(3) ast 基质液称取 -酮戊二酸 29.2mg，dl-门冬氨酸 2.66 g，置于亦小烧杯中，加入1n氢氧化钠溶解，丙校正ph 至 7.4，再用 ph7.4 的磷酸缓冲液定容至100ml，置冰箱中保存备用

9、（可保存一周） 。(4) 0.02% 2，4二硝基苯肼溶液称取 20mg2，4二硝基苯肼先溶解于10 ml 纯盐酸中，电炉加热助溶，待2，4二硝基苯肼全部溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，过滤后盛于棕色中，置冰箱中保存备用。(5) 1mol/l naoh 溶液：称取 4g naoh 溶解于蒸馏水后，定容到100ml。(6) 0.4 mol/l naoh 溶液称取 16 g naoh溶解于蒸馏水后，定容到1000ml。3 实验方法(1) 样品的处理按 3.5 方法进行。(2) ast 标准曲线的制作1将测定所用试剂除氢氧化钠溶液外全部置于水浴箱内，预温至然后使用取6 支试管，按表 6进行配制表

10、6ast 标准曲线的配制试管编号试剂(ml) 0 1 2 3 4 5 20 mol/l 丙酮酸钠标准溶液0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 ast 基质液0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1mol/l 磷酸缓冲液（ ph7.4）0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 混匀，将各管置于37水浴中保温 60min 2,4-二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，将各管置于37水浴中保温 20min 0.4 mol/l naoh 溶液5 5 5 5 5 5 混匀，将各管置于37水浴中保温 10min 2冷却后以 0 管为对照用分光光度计比色测定吸光值od520nm。3以丙酮酸含量为纵坐标，吸光值od520nm为横坐标绘制标准曲线 (