第二章质粒DNA的微量提取(SDS法)

1、实验二实验二质粒质粒DNA的微量提取的微量提取碱裂解法碱裂解法（SDSSDS法）法）一一. .目的与要求目的与要求 通过质粒的一些基本特性、质粒DNA的提取技术，掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术。二二. .相关知识相关知识 质粒质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。绝大多数是一种小型的、环状的双链DNA分子。 广泛存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。 质粒DNA的存在区域和结构特征电镜中质粒DNA的形态 严谨型：

2、质粒的复制受到寄主细胞严格控制，与寄主细胞的复制偶联同步。因此，在一个细胞中只有1个或几个拷贝； 松驰型：质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200个拷贝。 用一定的药物处理，抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。 质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型：质粒类型：载体载体(Vector)： 用于携带用于携带重组重组DNADNA，并且能够使外源，并且能够使外源DNADNA一起复制或一起复制或表达的质粒表达的质粒( (运载工具运载工具) )。具备的条件。具备的条件: : 1.1.具备条件具备条件（1 1）易于鉴定；易于鉴定

3、；（2 2）在受体细胞中）在受体细胞中 可以独立复制；可以独立复制；（3 3）易于筛选；）易于筛选；（4 4）易于导入受体细胞。）易于导入受体细胞。2.2.结构特征结构特征(1)(1)抗性基因抗性基因（AmpicillinAmpicillin gene, gene, KanamycineKanamycine gene) gene)(2)(2)启始复制子启始复制子（oriori) )；(3)(3)多克隆位点多克隆位点(MSC)(MSC)；(4)(4)标记基因标记基因( (LacZLacZ gene) gene)。InsertEcoRIXhoI1.9kb DNA 是具有一定结构的物质，特殊的环境会

4、导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。三三. .原理：原理： SDS是一种阴离子表面活性剂，既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。四四. .细菌裂解的方法：细菌裂解的方法：(1)碱裂解法碱裂解

5、法：0.2molNaOH+1%SDS;(2)煮沸裂解法煮沸裂解法:沸水煮沸40s;(3)SDS裂解法：10%SDS, 用于质粒大量提取。五五.DNA.DNA浓度的测定：浓度的测定：(1)分光光度计法:碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常测定比较纯的样品。(2)荧光的强度法：(3)凝胶电泳比对法，与标准分子量相比较。六六. . 材料和仪器材料和仪器1.1.材料材料: : 含有质粒P3.5K-EGFP的大肠杆菌DH5。P3.5K-EGFP是一种酵母荧光表达载体，常用于检测酵母中外源基因表达强度和亚细胞定位。2.2.试剂：试剂： 裂解液一

6、，裂解液二，裂解液三，酚氯仿，异丙醇，70%乙醇，TE等。3.3.仪器设备：仪器设备： 高速离心机，移液器，摇床等4.加入400l新配制的裂解液二，加盖颠倒6-7次使之混匀，放置3-5min（不得超过5min）;七七.质粒微量提取的方法质粒微量提取的方法培养细菌培养细菌收集菌体收集菌体悬浮菌体悬浮菌体裂解菌体裂解菌体1.1.将带有质粒的DH5a接种到3-5ml含有amp抗生素的液体培养基，37培养12-16h;2.取液体培养液1.4ml于Ep管中，10000rpm离心1min，去掉上清液，重复步骤2；最后瞬时离心后，用移液器去除上清。（所有去除残液均用此法）（所有去除残液均用此法）3.加入20

7、0l裂解液一，涡旋混匀放置5min;5.加入350 L裂解液三 (乙酸钾溶液)，加盖后颠倒6-7次混匀，放置3-5min;中和复性中和复性6.用台式高速离心机，12000rpm离心10min。离心除杂离心除杂12.将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。9.沉淀用0.5mL70乙醇清洗一次，12000rpm离心5min，弃上清，重复9；11.加入20-30l含有20g/ml RNase的ddH2O或TE 溶解，室温放置15-30min，使DNA充分溶解.去蛋白沉淀洗涤7.将700 L上清移入另一干净离心管，加入等体积的酚、氯仿（700ul），12000rpm离心10min。10.瞬时离心，用移

8、液器将管底残余液体移除，小管倒置于吸水纸上，室温自然干燥至透明;样品干燥样品溶解样品保存8.取600 L上清到另一离心管中，加入等体积冰冻异丙醇，混匀，12000r/min离心5min，弃上清;离心收集(1)取2l提取的质粒DNA，加入98L蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);(2)蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。(3)加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值，并记录。(4) 通过计算确定DNA浓度或纯度，浓度单位为g /ml, dsDNA=50(OD260) 稀释倍数补充内容补充内容1.用分光光度计法定量用分光光度计法

9、定量DNA 260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。补充内容补充内容2.凝胶电泳检测凝胶电泳检测DNA的浓度的浓度实验步骤实验步骤实验步骤见下一个试验实验步骤见下一个试验琼琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方脂糖凝胶电泳技术的原理和方法法结果结果1%1%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，90V,4090V,40分钟。分钟。NEB NEB 标准分子量片段标准分子量片段(1kb DN

10、A (1kb DNA Ladder)Ladder)1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder虽然不能对虽然不能对DNADNA质量进质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。条带进行比较估算出大概的数据。片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 0.5kb 的条带由的条带由500bp500bp和和517bp517bp组组成，这样即使在低分子量区域条成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。带的强度也比较均一。 按0.5g上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍 存在的问题及注意事项1.无DNA沉淀或沉淀少：（1）不含有质粒；（2）裂解液2失效；（3）异丙醇沉淀时没