发酵分析—色谱分析概述

1、第一节第一节 色谱法概述色谱法概述 混合物最有效的分离、分析方法。混合物最有效的分离、分析方法。 俄国植物学家茨维特在俄国植物学家茨维特在19061906年使用的装置：年使用的装置：色谱原型装置，如图。色谱原型装置，如图。 色谱法是一种分离技术，色谱法是一种分离技术， 试样混合物的分离过程也就是试样中各组试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。分配过程。 其中的一相固定不动，称为其中的一相固定不动，称为固定相固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液

2、体），称为体（气体或液体），称为流动相流动相。 碳酸钙碳酸钙（固定相）（固定相）色素混合液色素混合液石油醚石油醚 (流动相）流动相）1906年，年，Tsweet发现色谱分离现象发现色谱分离现象色谱柱色谱柱植物色素分离图示植物色素分离图示（1）分离效率高分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2 2） 灵敏度高灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3） 分析速度快分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4 4） 应用范围广应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不

3、稳定、生物试样的分离分析。 不足之处：不足之处： 被分离组分的定性较为困难。1按两相分子的聚集状态分类按两相分子的聚集状态分类超临界流体色谱法超临界流体色谱法流动相为超临界流体流动相为超临界流体色谱法分类（续前）2按固定相的固定方式分类按固定相的固定方式分类3按分离机制分类按分离机制分类毛细管电泳毛细管电泳色谱过程色谱过程指被分离组分在两相中的指被分离组分在两相中的“分配分配”平衡过平衡过程程以吸附色谱为例以吸附色谱为例见图示见图示 吸附吸附 解吸解吸再吸附再吸附 再解吸再解吸 反复多反复多次洗脱次洗脱被测组分分配系数不同被测组分分配系数不同 差速迁差速迁移移 分离分离l分配系数的微小差异分配

4、系数的微小差异吸附能力的微小差异吸附能力的微小差异l微小差异积累微小差异积累较大差异较大差异吸附能力弱的组分先吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出流出；吸附能力强的组分后流出back色谱分离原理色谱分离原理色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量色谱分离特点色谱分离特点 1不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等 提供了分离的可能性提供了分离的可能性 2各组分沿柱子扩散分布各组分沿柱子扩散分布峰宽峰宽 不利于不同组分分离不利于不同组分分离三、

5、色谱流出曲线与术语三、色谱流出曲线与术语1.1.基线基线 无试样通过检测器时，无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。检测到的信号即为基线。2.2.保留值保留值 （1）时间表示的保留值）时间表示的保留值 保留时间（保留时间（tR）：）：组组分从进样到柱后出现浓度分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；极大值时所需的时间； 死时间（死时间（tM）：）：不与固定相作用的气体（如空气）的保不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；留时间； 调整保留时间（调整保留时间（tR ）：）：tR= tRtM （2）用体积表示的保留值）用体积表示的保留值 保留体积（保留体积（VR）：）： VR = tRF0

6、F0为柱出口处的载气流量，为柱出口处的载气流量，单位：单位：m L / min。 死体积（死体积（VM）：）： VM = tM F0 调整保留体积调整保留体积(VR)： V R = VR VM 3 3. . 区域宽度区域宽度 用来衡量色谱峰宽度的参用来衡量色谱峰宽度的参数，有数，有三种表示方法三种表示方法：（1）标准偏差标准偏差( )：即即0.607倍倍峰高处色谱峰宽度的一半。峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一色谱峰高一半处的宽度半处的宽度 Y1/2 =2.354 （3）峰底宽峰底宽(Wb)：Wb=4 分配系数和容量因子：相平衡参数分配系数和容量因子：相平衡参数

7、分配系数分配系数K(平衡常数平衡常数)：指在一定温度和压力下，指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比（色谱过程的相平衡参数）相中的浓度比（色谱过程的相平衡参数）mSCCK (1) (1) 利用保留值及其规律定性利用保留值及其规律定性 各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此因此保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标。 利用纯物质对照定性利用纯物质对照定性 利用文献值对照定性利用文献值对照定性l实现方法实现方法利用保留时间定性利用保留时间定性 用相对保留值定性

8、用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性 122,1ttl 实现方法实现方法测定保留指数测定保留指数I I l 优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。性和精密度；只与固定相和柱温有关。l 缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。l 适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。（2）与其他分析仪器联用的定性方法SampleSampleGas Chromatograph (GC)Mass Spectrometer (MS)Separati

9、onIdentificationl 色质谱联用仪（色质谱联用仪（GC-MSGC-MS；LC-MSLC-MS）l 色谱色谱- -红外光谱仪联用仪；红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定组分的结构鉴定: :n 外标法外标法外标法也称为标准曲线法外标法也称为标准曲线法。特点及要求：特点及要求： 外标法不使用校正因子，准确性较高外标法不使用校正因子，准确性较高 操作条件变化对结果准确性影响较大操作条件变化对结果准确性影响较大 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析量试样的快速分析n 内标法内标法原理：原理：利用被测物与内标物校正因子的比值不变来进行定

10、量的。首先用被测物标准品和内标物配制标准溶液，求得校正因子比值： 然后，样品中加入内标物，再由它和样品的峰面积来计算： fisfi/fs 内标物与被测组份校正因子的比值； mi被测组份i的含量； ms加入内标物的量； As内标物的峰面积； Ai组份i的峰面积；issisiAmAmffisfsississiAAmisAAmffifm(a) (a) 内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。变动对定量结果的影响不大。(b) (b) 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分

11、析。批量试样的快速分析。内标物要满足以下要求：内标物要满足以下要求：（a a）试样中不含有该物质；试样中不含有该物质；（b b）与被测组分性质比较接近；与被测组分性质比较接近；（c c）不与试样发生化学反应；不与试样发生化学反应；（d d）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰响。出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰响。内标法特点内标法特点与外标法比较：1. 外标法：标准样品标准样品AACC2. 内标法：标准内标标准样品内标样品标准内标标准样品内标样品AAAACCCC可以推导出：样品内标标准内标标准标准标准内标样品内标样品样品CCCCAAAA思考题思考题l色谱分离的原理及过程。色谱分离的原理

12、及过程。第二节第二节 薄层层析（薄层层析（ Thin-layer Thin-layer chromatography chromatography ）1、基本原理、基本原理薄层层析法是色谱分析技术的一种薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同组分的吸附力不一样，不同组分由于吸附剂对不同组分的吸附力不一样，不同组分在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合样品随着展开剂的移

13、动速率也不同，因而可以彼此样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附分开。（即通过吸附-解吸解吸-再吸附再吸附-再解吸的反复进再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）行，而将样品各组分分离开来）Thin-Layer Chromatography: A Two-Component MixtureMore polar!Less polar!solvent frontoriginmixturesolvent frontcomponent Bcomponent Aoriginsolvent frontcomponent Bcomponent AoriginIncreasing D

14、evelopment TimeThin-Layer Chromatography: Determination of Rf Valuessolvent frontcomponent Bcomponent AorigindSdBdARf of component A = dA dSRf of component B = dB dSThe Rf value is a decimal fraction, generally only reported to two decimal placesThin-Layer Chromatography: Qualitative AnalysisA B unk

15、nown固定相：氧化铝OAlOOAlOOHAlOOHAlOOHAlOHOAcidic: -Al-OHNeutral: -Al-OH + -Al-O-Basic: -Al-O-硅胶吸附薄层层析硅胶吸附薄层层析l 吸附薄层中常用的吸附剂为吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶氧化铝和硅胶 l 硅胶：表达式为硅胶：表达式为SiOSiO2 2XHXH2 2O O。层析用硅胶是一种。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性性硅醇基（硅醇基（Si SiOHOH），），这种极性的硅醇基能和这种极性的硅醇基能和许多化合物形成许多化合物形成氢键氢键而产

16、生吸附而产生吸附. .OHSiOOHSiOOOOHSiOOOHSiOOOHSiOOOSiOOSiOOSiOOSiOOOSiOOSiOOSiOOO硅胶吸附薄层层析的特点：硅胶吸附薄层层析的特点： 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。性也与含水量呈负性相关。硅醇基显较弱的硅醇基显较弱的酸性酸性，因而，硅胶只能用，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。分离。硅胶的活化温度通常为硅胶的活化温度通常为105105110110，不，不能过高。能过高。2、操作步骤、操作步骤薄层板的

17、制备薄层板的制备 展开剂的选择展开剂的选择 Ala Arg Gly Mix轻触疾起轻触疾起操作步骤操作步骤点样点样 (a)点状点样 (b)条状点样 (c)颈部点样 (d)沟槽点样 半自动点样仪半自动点样仪手动点样器手动点样器操作步骤操作步骤 展层、显色展层、显色Ala Arg Gly Mix物理显色物理显色 含有共轭双键的有机物质能吸收紫外光，将分离后的含有共轭双键的有机物质能吸收紫外光，将分离后的薄层板置于紫外灯下，组分薄层呈现暗色斑；如果采薄层板置于紫外灯下，组分薄层呈现暗色斑；如果采用硅腔用硅腔GF(或其它含有荧光指示剂的吸附剂或其它含有荧光指示剂的吸附剂)铺成的薄铺成的薄层，在紫外光照

18、射下，整个薄层呈显黄绿色荧光，斑层，在紫外光照射下，整个薄层呈显黄绿色荧光，斑点部分呈现暗色，更为明显。点部分呈现暗色，更为明显。 利用利用蒸气熏显色蒸气熏显色时，常用的试剂有固体碘、浓氨水、时，常用的试剂有固体碘、浓氨水、液体溴。进行显色时，把这些易挥发的试剂放置在密液体溴。进行显色时，把这些易挥发的试剂放置在密闭容器内（例如标本瓶、标本缸、干燥器等），使它闭容器内（例如标本瓶、标本缸、干燥器等），使它们的蒸气充满整个容器，将已展开并已挥发去溶剂的们的蒸气充满整个容器，将已展开并已挥发去溶剂的薄层板放入其中，使之显色。薄层板放入其中，使之显色。 化学显色化学显色的方式通常有直接喷雾法和浸渍法

19、两种。的方式通常有直接喷雾法和浸渍法两种。 化学显色常用的显色剂剂大致可以分为两类，即通用显色化学显色常用的显色剂剂大致可以分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。剂和专属性显色剂。通用显色剂：对未知化合物的检测，可以考虑先用通用显通用显色剂：对未知化合物的检测，可以考虑先用通用显色剂。这种显色剂是利用它与被测组分的氧化还原反应、色剂。这种显色剂是利用它与被测组分的氧化还原反应、脱水反应及酸碱反应等而显色的，常用的有脱水反应及酸碱反应等而显色的，常用的有50的硫酸溶的硫酸溶液、酸碱指示剂溶液、液、酸碱指示剂溶液、5磷钼酸乙醇溶液、荧光显色剂磷钼酸乙醇溶液、荧光显色剂等。等。 ： 结果计算结果计算

20、lRf =斑点至原点距离斑点至原点距离溶剂前缘至原点距离溶剂前缘至原点距离 小心量出斑点中心至原点中心距小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的离，计算出它们的 值。值。 根据根据值，鉴定出混合样品中值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。氨基酸的种类，并绘出层析图谱。薄层色谱扫描仪薄层色谱扫描仪 定义：定义： 纸色谱分离法又称纸层析法，是根据不纸色谱分离法又称纸层析法，是根据不同物质在两相中的同物质在两相中的分配系数分配系数不同而进行分不同而进行分离的一种微量分离方法。离的一种微量分离方法。载体载体层析纸（滤纸）；

21、层析纸（滤纸）；固定相固定相滤纸上的吸湿水分；滤纸上的吸湿水分；流动相流动相有机溶剂（展开剂）。有机溶剂（展开剂）。纸色谱纸色谱思考题思考题l简述简述TLC的操作步骤。的操作步骤。l概念：概念：离子交换分离法是利用离子交换分离法是利用离子交换离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应应进行分离的方法。进行分离的方法。（二）离子交换色谱（二）离子交换色谱仪器设备简介仪器设备简介离子交换全套装置离子交换树脂的结构离子交换树脂的结构-网络骨架网络骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系离子交换树脂结构骨架：骨架：接有功能基团，本身是惰性接有功能基团，本身是惰性功能基

22、团：功能基团：连接在骨架上，可与相连接在骨架上，可与相反离子结合反离子结合待交换分子：待交换分子：在吸附阶段可与活在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基性离子交换，与骨架上的功能基团结合团结合活性离子：活性离子：与功能基团所带电荷相与功能基团所带电荷相反的可移动的离子反的可移动的离子u活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换u活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换 基质基质 电荷基团电荷基团 反离子反离子商品名商品名纤维素纤维素 OCH2COO- Na+ +C

23、M-纤维素纤维素纤维素纤维素-O-O-（CHCH2 2）2 2- -N N+ +H H（C C2 2H H5 5）2 2 ClCl- -DEAE-纤维素纤维素聚苯乙烯聚苯乙烯SO3 3- - Na+ +732阳离子树阳离子树脂脂 聚苯乙烯聚苯乙烯N N+ +（CH2）4 4 ClCl- -717阴离子树阴离子树脂脂聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备离子交换树脂的形状结构示意图离子交换树脂的形状结构示意图带带正正电荷多电荷多蛋白紧密结合蛋白紧密结合带带负负电荷多电荷多蛋白流过层析蛋白流过层析柱柱阳离子交换树脂工作示意图阳离子交换树脂工作示意图离子交换拄层析操作方式离子交换拄层析操作方式一、离子交换剂的处理、转型和再生一、离子交换剂的处理、转型和再生二、分离物质的交换二、分离物质的交换三、物质的洗脱与收集三、物质的洗脱与收集 一、离子交换剂的处理和转型一、离子交换剂的处理和转型l 一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性l 疏水性离子交换剂疏水性离子交换剂 用用2-42-4倍的倍的2mol/L 2mol/L NaOHNa