第2章 基因工程 上(西南大学 普通生物学)

1、基因工程的优点基因工程的优点第二章第二章 基因工程基因工程原核生物与真核生物、动物与植物原核生物与真核生物、动物与植物的遗传信息进行相互重组和转移的遗传信息进行相互重组和转移打破打破物种界限物种界限可实现可实现基因工程研究的理论依据基因工程研究的理论依据2）基因是可切割）基因是可切割1）不同基因具有相同的遗传物质）不同基因具有相同的遗传物质3）基因是可以转移）基因是可以转移4）多肽与基因之间存在对应关系）多肽与基因之间存在对应关系5）遗传密码是通用的）遗传密码是通用的6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代第一节第一节 DNA重组重组一、一、DNA1、

2、核酸的组成与结构核酸的组成与结构DNA是一类由四种脱氧是一类由四种脱氧核苷酸（核苷酸（A、T、G、C）聚合而成的大分子聚合而成的大分子核苷酸分子由核苷酸分子由戊糖、磷酸和碱基戊糖、磷酸和碱基组成。组成。（1）核酸的组成）核酸的组成碱基碱基核糖核糖核苷核苷核苷酸核苷酸（2）DNA的结构的结构单链单链DNA双链双链DNA（1）DNA分子能在细胞内复制分子能在细胞内复制2、DNA的功能的功能（2）携带遗传信息）携带遗传信息DNA分子上只有分子上只有编码基因的片段编码基因的片段才能转录合成相应才能转录合成相应的的RNA（mRNA、rRNA、tRNA）。）。1）DNA分子转录合成分子转录合成RNAmRN

3、ATUtRNA核糖体核糖体RNA (rRNA)原核生物原核生物原核生物原核生物2）mRNA翻译合翻译合成蛋白质成蛋白质缬酪色二、二、 限制性内切核酸酶和限制性内切核酸酶和DNA片段化片段化 基因工程的关键技术基因工程的关键技术是是DNA的连接、重组，但的连接、重组，但是是DNA在连接之前必须进在连接之前必须进行加工，把行加工，把DNA分子切割分子切割成所需要的片段。成所需要的片段。在合适条件下，使每条在合适条件下，使每条DNA的一个磷酸二酯键断开，的一个磷酸二酯键断开，1、限制性核酸内切酶（、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）一类以环状或线形双链一类以环状或线

4、形双链DNA为底物，为底物，能识别能识别DNA中的特定核苷酸序列，中的特定核苷酸序列，产生产生3-OH和和3-P基团基团DNA片段片段的的脱氧核酸内切酶脱氧核酸内切酶(endodeoxyribonuclease)。III型酶：识别和切割相差限定数核苷酸。型酶：识别和切割相差限定数核苷酸。分为分为I、II、III型酶型酶。基因工程中使用的为。基因工程中使用的为酶酶。限制性内切酶限制性内切酶I型酶：先识别，移动后在切割。型酶：先识别，移动后在切割。II型酶：识别处切割型酶：识别处切割DNA。限制性内切酶在限制性内切酶在DNA 分子上能识别的特定核苷酸序列分子上能识别的特定核苷酸序列3CTTAAG5

5、2、限制性核酸内切酶的识别序列、限制性核酸内切酶的识别序列识别序列识别序列(识别位点识别位点)如：如：EcoR I的识别序列为的识别序列为5GAATTC3不同限制性内切酶产生不同限制性内切酶产生DNA片段大小片段大小型限制性内切酶的切割位点处在识别序列内型限制性内切酶的切割位点处在识别序列内3、限制性核酸内切酶的酶切位点、限制性核酸内切酶的酶切位点同裂酶同裂酶（isoschizomer）有一些限制性内切酶虽来源不同，但有相同的识别序列。有一些限制性内切酶虽来源不同，但有相同的识别序列。BamH I和和Bs I具有相同识别序列具有相同识别序列如：如：5GGATCC3 3CCTAGG5两条链断裂的

6、位置处在识别序列的对称结构中心，产两条链断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产生的生的DNA末端是平齐的。末端是平齐的。两条链断裂呈交错对称，产生的两条链断裂呈交错对称，产生的DNA末端的一条链多末端的一条链多出几个核苷酸，成为凸出末端。出几个核苷酸，成为凸出末端。粘性末端粘性末端（sticky end）平齐末端平齐末端（blunt end）限制性内切虽然识别序列不同，但切割限制性内切虽然识别序列不同，但切割DNA片段具片段具有相同的粘性末端。有相同的粘性末端。BamH I的识别序列的识别序列GGATCC同尾酶同尾酶（isocaudamer）Bcl I的识别序列的识别序列TGATCA如：如：

7、4、限制性内切核酸酶反应系统、限制性内切核酸酶反应系统底物（环状或线状双链底物（环状或线状双链DNA）缓冲液缓冲液温度（温度（37）3）部分酶切）部分酶切5、限制性内切核酸酶酶切、限制性内切核酸酶酶切DNA的方法的方法1）单酶切）单酶切2）双酶切）双酶切三、特异性三、特异性DNA片段的片段的PCR扩增扩增DNA聚合催化（聚合催化（70-75）使引物）使引物延伸延伸。1、PCR原理原理PCR包括包括3个反应个反应双链双链DNA变性变性成单链成单链复性复性（36-60）引物同单链引物同单链DNA互互补序列结合补序列结合变性变性（90-95）延伸延伸（70-75）如此经过如此经过25-40次循环。次

8、循环。以单链或双链以单链或双链DNA为模板为模板2、DNA聚合酶聚合酶(polymerase)一种催化由脱氧核糖核苷酸合成一种催化由脱氧核糖核苷酸合成DNA的酶的酶称为称为依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶催化催化合成合成DNA互补链的互补链的条件条件四种脱氧核苷四种脱氧核苷5-三磷酸三磷酸带有带有3-OH游离基团的引物链游离基团的引物链DNA摸板，双链摸板，双链DNA只有在糖只有在糖-磷主链磷主链上有缺口时，才是有效的摸板。上有缺口时，才是有效的摸板。最大最大特点特点：耐高温。：耐高温。Taq DNA聚合酶聚合酶一种耐热的依赖一种耐热的依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶具具

9、53聚合酶活性聚合酶活性具具53外切酶活性外切酶活性通过切口平移标记通过切口平移标记DNA分子，测序。分子，测序。DNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌PolA基因编码的一种单链基因编码的一种单链DNA聚合酶聚合酶Pol有三种不同的酶活性有三种不同的酶活性53的聚合酶活性的聚合酶活性53的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3 5的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性DNA聚合酶聚合酶的的主要用途主要用途修补经限制酶消化的修补经限制酶消化的DNA所形成的所形成的3隐蔽末端，隐蔽末端，标记标记DNA末端，末端，cDNA克隆中克隆中第二链的合成，第二链的合成，DNA序列测定。序列测定。大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶

10、聚合酶的的Klenow片段片段又叫又叫Klenow聚合酶聚合酶或或Klenow大片段酶大片段酶是由大肠杆菌是由大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶全酶经枯草杆菌蛋全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段分子。白酶处理后产生的大片段分子。Klenow聚合酶的聚合酶的功能功能53的聚合酶活性的聚合酶活性3 5的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性Klenow聚合酶的聚合酶的主要用途主要用途T4DNA聚合酶聚合酶T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的殊的DNA 聚合酶聚合酶具具53的聚合酶活性的聚合酶活性3 5的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性用途用途标记探针标记探

11、针DNA片段，片段，DNA测序。测序。合成的合成的长度长度比其他聚合酶要长比其他聚合酶要长T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶来源来源T7噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌持续合成最强的持续合成最强的DNA聚合酶聚合酶逆转录酶（逆转录酶（Reverse transcriptase）主要作用主要作用一类依赖于一类依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶以以RNA为模板为模板催化脱氧催化脱氧-5-三磷酸合成三磷酸合成DNA具有具有Rnase H活性活性将将mRNA反转录反转录成成cDNA3、PCR引物引物5353能够引导模板能够引导模板DNA互补链合成的寡聚核苷酸互补链合成的寡聚核苷酸3-OH15-

12、30个核苷酸个核苷酸GC含量含量40-60%浓度一般为浓度一般为0.1-0.5mol/L 4、DNA片段扩增系统片段扩增系统5353P4P3P1P2 巢式巢式/套式套式PCR （Nested polymerase chain reaction）再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物 第一次扩增所用引物第一次扩增所用引物第二次扩增作用的引物第二次扩增作用的引物先用一对引物对模板进行扩增先用一对引物对模板进行扩增因为同两套引物都互补的靶序列很少降低因为同两套引物都互补的靶序列很少降低了扩增多个靶位点的可能性了扩增多个靶位点的可能性外引物外引物内引物内引物主要用

13、于极少量的模板的扩增主要用于极少量的模板的扩增 优点优点用途用途反向反向PCR（reverse PCR） 扩增引物与扩增引物与PCR序列方向相反序列方向相反 主要用于已知序列两翼未知主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增序列的扩增 不对称不对称PCR（asymmetric PCR） 两种引物比例相差较大的两种引物比例相差较大的PCR用于制备核酸序列分析的单链用于制备核酸序列分析的单链DNA片段片段或核酸杂交的探针或核酸杂交的探针 在一通用引物反转录的在一通用引物反转录的cDNA3端加上一段已端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行进

14、行PCR。锚定锚定PCR可用于未知可用于未知cDNA的制备及低丰度的制备及低丰度cDNA文库的构建文库的构建降解源自脱嘌呤作用，即降解源自脱嘌呤作用，即DNA分子中碱基和分子中碱基和戊糖间的氮糖苷键发生水解。戊糖间的氮糖苷键发生水解。 长程长程PCR长程长程PCR系统可扩增系统可扩增20kb以上的片段以上的片段在一般条件下，难以扩增大于在一般条件下，难以扩增大于5kb的的DNA片段片段主要原因主要原因扩增大片段时标准缓冲液在高温下不能保持正扩增大片段时标准缓冲液在高温下不能保持正常的常的pH值，从而导致模板值，从而导致模板DNA降解，降解，由于由于Taq酶只能以酶只能以DNA为模板，当待扩增模

15、板为为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为时，需先将其反转录为cDNA才能进行才能进行PCR扩增扩增反转录反转录PCR（reverse transcription PCR）在同一反应中用多组引物同时扩增几种基本片段在同一反应中用多组引物同时扩增几种基本片段多重多重PCR（multiple PCR)直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增扩增原位涂片原位涂片PCR定量定量PCR（real-time PCR）PCR扩增时，扩增时，Taq酶的酶的5-3外切酶活性将探针外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，

16、团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光。每扩增一从而发出荧光。每扩增一条条DNA链，就有一个荧光链，就有一个荧光分子形成。分子形成。通过对通过对PCR终产物的分析或终产物的分析或PCR过程的监测，进行过程的监测，进行PCR起始模板量的定量起始模板量的定量荧光定量荧光定量PCR技术技术荧光探针荧光探针:荧光发射基荧光发射基团团和一个和一个荧光淬灭基荧光淬灭基团团。为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的外转录及序列分析等，可在引物的5端加上酶切位端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等点、突变序列、转

17、录启动子及序列分析物结合位点等修饰引物修饰引物PCR四、四、DNA片段的化学合成片段的化学合成1、合成引物、合成引物2、合成、合成DNA寡聚合核苷酸连杆（寡聚合核苷酸连杆（linker）也称为衔接物或接头也称为衔接物或接头3、合成基因片段、合成基因片段最适温度最适温度37,五、五、DNA片段的连接重组片段的连接重组1、DNA连接酶（连接酶（ligase）能够催化两个能够催化两个DNA片段末端之间的片段末端之间的-P基团和基团和-OH基团形成磷酸二酯键的酶基团形成磷酸二酯键的酶DNA连接酶反应温度连接酶反应温度一般采用一般采用16-20 。由大肠菌由大肠菌DNA编码的编码的DNA 连接酶连接酶大

18、肠菌大肠菌DNA 连接酶连接酶也能也能连接用不同内切酶切割产生的平齐末端连接用不同内切酶切割产生的平齐末端只能只能连接具互补粘性末端的连接具互补粘性末端的DNA片段片段T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶由由T4噬菌体噬菌体DNA编码的编码的DNA 连接酶连接酶既能既能连接具互补粘性末端的连接具互补粘性末端的DNA片段片段2、DNA片段之间的连接片段之间的连接（1）粘性末端）粘性末端DNA片段的连接片段的连接直接连接直接连接转化成平齐末端再连接转化成平齐末端再连接使使DNA平齐末端的平齐末端的3-OH加上同聚核苷酸，产生加上同聚核苷酸，产生具有具有poly(A) 、 poly(T) 、poly(

19、G) 、poly(C)的的粘性末端。粘性末端。（2） DNA末端修饰后的连接末端修饰后的连接1）DNA片段末端修饰酶片段末端修饰酶末端脱氧苷酸转移酶末端脱氧苷酸转移酶简称为简称为末端转移酶末端转移酶可以切去可以切去DNA片段的凸出末端，成为平齐末端。片段的凸出末端，成为平齐末端。核酸外切酶核酸外切酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）催化核酸分子脱掉催化核酸分子脱掉5 P基团基团,转换成为转换成为5 OH的酶。的酶。碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ）使使DNA或或RNA的去的去磷酸化，防止磷酸化，防止DNA的自身环化。的

20、自身环化。主要作用主要作用若同聚物不等若同聚物不等长，需用长，需用DNA聚合聚合酶酶或或Klenow大片大片段酶填补。再用段酶填补。再用DNA连接酶连接。连接酶连接。同聚物加尾法同聚物加尾法（homopolymer tailing）2）DNA末端修饰后的连接末端修饰后的连接衔接物连接法衔接物连接法用化学方法合成用化学方法合成的一段由的一段由10-12个核苷个核苷酸组成、具有一个或酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点数个限制酶识别位点的平末端的双链的平末端的双链DNA寡聚核苷酸片段。寡聚核苷酸片段。衔接物衔接物（linker）接头连接法接头连接法接头接头（adaptor）能够携带外源基因进入受体

21、细胞的能够携带外源基因进入受体细胞的DNA分子。分子。承载外源承载外源DNA片段的片段的载体进入细胞后，以便筛载体进入细胞后，以便筛选克隆子。选克隆子。第二节第二节 基因克隆载体基因克隆载体载体载体（vector）（1）多克隆位点多克隆位点（ MCS，multiple cloning site）基因克隆载体必备条件基因克隆载体必备条件（2）复制原点复制原点(ORI, origin )（4）安全）安全能使能使外源外源DNA片段插入片段插入能进行自我复制能进行自我复制（3）选择标记基因选择标记基因一、质粒载体一、质粒载体质粒质粒（plasmid）染色体外能自我复制的双链闭合环染色体外能自我复制的双

22、链闭合环DNA分子，分子，广泛存在于细菌细胞中广泛存在于细菌细胞中松弛型复制质粒松弛型复制质粒在寄主细胞内，能复在寄主细胞内，能复制几百上千个拷贝。制几百上千个拷贝。严紧型复制质粒严紧型复制质粒在寄主细胞内，只能复在寄主细胞内，只能复制少数几个拷贝。制少数几个拷贝。外源基因插入的外源基因插入的多克隆位点多克隆位点（MCS）构建质粒载体构建质粒载体一般选用一般选用分子小分子小的松弛型复制质粒的松弛型复制质粒应具有应具有复制起始点复制起始点（ori），能够在），能够在受体细胞内复制。受体细胞内复制。此外，质粒还有此外，质粒还有1-2个个选择标记基因选择标记基因（Ampr、 Kanr 、Cmr、Te

23、tr、Lac Z ）BR分别为分别为Boliver & Rodrigue首字母缩首字母缩写写1 、大肠杆菌质粒载体、大肠杆菌质粒载体（1）pBR322质粒质粒p表示质粒表示质粒氨苄青霉素（氨苄青霉素（Ampr，Tn3 ）pMB1 （类似（类似 Col E1质粒，具质粒，具大肠杆菌素大肠杆菌素E1合成酶基因）合成酶基因）四环素抗性（四环素抗性（Tetr，pSC101 ）基因）基因复制原点复制原点选择标记基因选择标记基因多克隆位点多克隆位点（multiple cloning site）TcR内有内有11个限个限制性内切酶位点，其制性内切酶位点，其启动子内启动子内2个个64个限制性内个限制性

24、内切酶位点切酶位点ApR内有内有6个限制个限制性内切酶位点性内切酶位点大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码的启动子及编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -肽链的肽链的DNA序列序列(lacZ基因基因)（2）pUC质粒载体质粒载体Messing & Vieria （University of California）1987年构建年构建pBR322质粒的复制起点质粒的复制起点（ori）氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）lacZ 内有内有13个酶切位点的多个酶切位点的多克隆位点。克隆位点。pUC18 pUC19 X-Gal is a noninduc

25、ing chromogenic substrate for beta-galactosidase, which hydrolyzes X-Gal forming an intense blue precipitate. X-GaI is most frequently used in conjunction with IPTG in blue/white colony screening to detect recombinants (white) from non-recombinants (blue) X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galac

26、topyranoside5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚半吲哚半乳糖苷乳糖苷 IPTG induces activity of beta-galactosidase, an enzyme that promotes lactose utilization, by binding and inhibiting the lac repressor. IPTG is used to induce lacZ gene expression in cloning experimentsIPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半

27、乳糖苷有多克隆位点有多克隆位点酵母穿梭质粒载体酵母穿梭质粒载体2、穿梭质粒载体（、穿梭质粒载体（shuttle vector）能在能在两种不同的生物两种不同的生物（原核生物、真核细胞）（原核生物、真核细胞）中复制的载体中复制的载体有有细菌质粒细菌质粒的复制原点及选择标记基因的复制原点及选择标记基因有有真核生物真核生物的自主复制序列（的自主复制序列（ARS）和选择标记基因）和选择标记基因蓝藻穿梭质粒载体蓝藻穿梭质粒载体可可诱导植物产生瘤细胞诱导植物产生瘤细胞( Tumor- inducing, Ti )，3、Ti质粒质粒（Ti plasmid）载体）载体一种细菌质粒一种细菌质粒存在于土壤农杆菌存

28、在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens）中）中冠瘿瘤（冠瘿瘤（grown gall tumors)。根据根据Ti质粒诱导的植物冠质粒诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，可以分成不同，可以分成四种四种类型：类型：1） Ti质粒的类型质粒的类型农杆菌素碱农杆菌素碱型（型（agrocinopine）章鱼碱型章鱼碱型（octopine）烟脂碱型烟脂碱型（nopaline）农杆碱型农杆碱型（agropine）或称琥珀碱型（或称琥珀碱型（succnamopine）2）Ti质粒的结构质粒的结构该该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关片段上的基因与肿瘤的

29、形成有关T-DNA区区转移转移DNA （transferred-DNA region）农杆菌侵染植物细胞时，从农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转质粒上切割下来转移到植物细胞的一段移到植物细胞的一段DNA该区段上的基因能该区段上的基因能激活激活T-DNA转移转移，使农杆菌表现，使农杆菌表现出毒性出毒性Vir区区毒区毒区（virulence region）T-DNA区区与与Vir区在质粒区在质粒DNA上彼此相上彼此相邻，合起来约占邻，合起来约占Ti质粒质粒DNA的的三分之一三分之一该区段上存在细菌间接合转移的有关基因（该区段上存在细菌间接合转移的有关基因（tra），），调控调控Ti质粒在

30、农杆菌之间的转移。质粒在农杆菌之间的转移。Con区区接合转移编码区接合转移编码区冠瘿碱能激活冠瘿碱能激活tra基因，诱导基因，诱导Ti质粒转移质粒转移（conjugation encoding region）该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制质粒的自我复制Ori区区复制起始复制起始（origin of replication）使用无毒（使用无毒（non-oncogenic） 解武装（解武装（disarmed）质粒作载体，又称质粒作载体，又称Onc载体法。载体法。3）Ti质粒的构建质粒的构建共合载体共合载体法法Onc载体缺失载体缺失T-DNA由常用质粒由常用质粒取代。并通过同源取代。

31、并通过同源重组与相应的载体重组与相应的载体形成共合载体。形成共合载体。将带有外源基因的将带有外源基因的T-DNA和和vir区安置在不同区安置在不同的质粒载体上。的质粒载体上。双元载体双元载体4、酵母、酵母2m质粒载体质粒载体共价闭环共价闭环DNA分子分子(cccDNA)平均周长平均周长2m每个酵母细胞里约有每个酵母细胞里约有100个拷贝个拷贝5、T-克隆载体和克隆载体和U-克隆载体克隆载体Taq酶常在延伸酶常在延伸PCR产物产物3末端加上一个末端加上一个非配对的碱基非配对的碱基A。TA克隆克隆(载体载体)利用利用5端带有不配对碱基端带有不配对碱基T的线性质粒（的线性质粒（ T-克隆克隆载体），

32、对载体），对PCR产物以产物以AT配对连接进行的克隆配对连接进行的克隆5端带有一个不配对碱基端带有一个不配对碱基U的线性质粒。的线性质粒。T容易与其他碱基发生非特异配对。用突出的容易与其他碱基发生非特异配对。用突出的U末末端代替端代替T末端，由于末端，由于U碱基能够有效减低和其他碱基（碱基能够有效减低和其他碱基（T、C、G）非特异退火的几率，因而能有效提高）非特异退火的几率，因而能有效提高PCR产物产物的克隆效率。的克隆效率。U-克隆载体克隆载体二、噬菌体和病毒载体二、噬菌体和病毒载体1、噬菌体载体噬菌体载体线状双链线状双链 DNA全长全长49kb（48502bp）DNA进入寄主细胞后，粘进入

33、寄主细胞后，粘性末端互补配对形成双链环状性末端互补配对形成双链环状分子，结合处称为分子，结合处称为cos位点位点。(1)噬菌体的特点噬菌体的特点1) 具具cos位点位点粘性末端粘性末端（cohesive end, cos )线状两端线状两端5 各有各有12个核苷酸的单链突出个核苷酸的单链突出 DNA可以可以整整合到寄主细胞染色合到寄主细胞染色体体，以溶源状态存，以溶源状态存在，并随染色体的在，并随染色体的复制而复制。复制而复制。2）温和噬菌体）温和噬菌体当紫外线或当紫外线或45处理，释放出处理，释放出 DNA，被外壳蛋白，被外壳蛋白包装，成为溶菌状包装，成为溶菌状态迅速增殖。态迅速增殖。噬菌体

34、能包装原噬菌体能包装原 DNA长度的长度的75-105%，约，约38-54kb。3）中间为非必须区）中间为非必须区不进行改造，允许承载不进行改造，允许承载5kb 的外源的外源DNA。中间有中间有约约20 kb的区的区域对域对噬菌噬菌体生长不是体生长不是绝对必须的。绝对必须的。4）D、E包装必须基因包装必须基因5） DNA上具多个限制性内切酶识别序列上具多个限制性内切酶识别序列当外源当外源DNA片段插入后使载体所具有的合成片段插入后使载体所具有的合成活性阻活性阻遏物遏物的功能遭受破坏，而不能进入的功能遭受破坏，而不能进入溶菌溶菌周期。周期。（2）噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建1）插入型载体）插

35、入型载体免疫失活插入型载体免疫失活插入型载体带有外源带有外源DNA插入的插入的重组体只能重组体只能形成清晰的噬菌斑，形成清晰的噬菌斑，而没有外源而没有外源DNA插插入的噬菌体形成混入的噬菌体形成混浊的噬菌斑。浊的噬菌斑。载体基因组中含有一个大肠杆菌的载体基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中区段，其中编码编码-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ。-半乳糖苷酶失活插入型载体半乳糖苷酶失活插入型载体外源外源DNA插入到插入到lacZ区段上，阻断了区段上，阻断了-半乳糖苷酶基半乳糖苷酶基因因lacZ的编码序列。的编码序列。在在噬菌体基噬菌体基础上改建的，在础上改建的，在其中央部分有一其中央部

36、分有一个可以被外源插个可以被外源插入入DNA分子所取分子所取代的代的DNA片段的片段的克隆载体。克隆载体。2）替换型载体替换型载体取代型载体取代型载体(substitution vector)DASH和和FIX替换型载体替换型载体2、M13噬菌体载体噬菌体载体环状单链环状单链DNA，6407bpM13mp187429bp含有含有8kb大小的双链大小的双链DNA病毒病毒3、CaMV基因克隆载体基因克隆载体花椰菜花斑病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）最大装载最大装载大于大于CaMV-DNA 300bp由缺陷型由缺陷型CaMV同辅助病毒组成。缺陷型同辅助病毒组成。缺陷型CaMV 仅具病毒少数功能基因，而

37、辅助病毒携带其他仅具病毒少数功能基因，而辅助病毒携带其他CaMV基因。基因。（1）CaMV载体的构建载体的构建互补载体系统互补载体系统把组装有外源把组装有外源DNA的的CaMV-DNA插入插入Ti 质粒载质粒载体，通过根癌农杆介导，转移到植物细胞内。体，通过根癌农杆介导，转移到植物细胞内。混合载体系统混合载体系统CaMV的的DNA在植物中在植物中高水平转录高水平转录35S RNA，其启动子是一强启动子。其启动子是一强启动子。CaMV 35S 启动子融合基因载体系统启动子融合基因载体系统将不含启动子的外源目的将不含启动子的外源目的基因组装在基因组装在35S启动子的启动子的下游，构建成可在植物中下

38、游，构建成可在植物中高效表达的载体。高效表达的载体。感染啮齿动物细胞后，病毒感染啮齿动物细胞后，病毒DNA可整合到寄主细胞可整合到寄主细胞的染色体的染色体DNA上。上。4、SV40载体载体SV40病毒病毒一个含一个含5243bp环状双链环状双链DNA的的猿猴空泡病毒猿猴空泡病毒40用外源用外源DNA分子取代分子取代SV40中部分中部分DNA（1）SV40(Simian Virus 40)载体的构建载体的构建取代型重组病毒载体取代型重组病毒载体晚期取代型晚期取代型早期取代型早期取代型分为分为SV40不能包装大于原不能包装大于原DNA的重组的重组DNA分子分子用用SV40的部分的部分DNA片段与质

39、粒重组而成片段与质粒重组而成重组型病毒质粒载体重组型病毒质粒载体进入细胞后，进入细胞后，RNA反转录反转录DNA，通过两端的长末端重通过两端的长末端重复序列（复序列（LRT）整合到染色体整合到染色体DNA上，成为上，成为原病毒原病毒。 4、反转录病毒克隆载体、反转录病毒克隆载体反转录病毒反转录病毒（retrovirus）一类一类RNA病毒病毒三、柯斯质粒（三、柯斯质粒（cosmid） “cos site-carrying plasmid”缩写而成。缩写而成。1、柯斯质粒、柯斯质粒人工构建的含有人工构建的含有DNA粘性粘性末端位点（末端位点（cos）序列和质序列和质粒复制子的特殊类型的质粒复制子

40、的特殊类型的质粒载体。粒载体。Cosmid pJB8Cosmid c2XB克隆外源克隆外源DNA的柯斯质粒可高效转导对的柯斯质粒可高效转导对噬菌体敏噬菌体敏感的寄主细胞，进入细胞后可感的寄主细胞，进入细胞后可环化（环化（cos位点），因位点），因不含全部不含全部噬菌体噬菌体DNA的基因，不能进入溶菌周期的基因，不能进入溶菌周期2、柯斯质粒的特点、柯斯质粒的特点1）具有）具有噬菌体噬菌体的特点的特点具质粒的复制子，能够像质粒一样进行复制，具质粒的复制子，能够像质粒一样进行复制，具抗菌素抗性基因具抗菌素抗性基因插入的外插入的外DNA片段可达片段可达30kb 以上以上2）具有）具有质粒质粒的特点的特

41、点3）具有）具有高容量高容量的克隆能力的克隆能力（site-specific homologus recombination）四、染色体定位整合载体四、染色体定位整合载体1、靶位、靶位受体细胞基因组中外源受体细胞基因组中外源DNA定位整合的定位整合的DNA区域（位置）。区域（位置）。2、基因打靶（、基因打靶（gene targeting）基因定位同源重组基因定位同源重组自主复制序列（一个或多个）自主复制序列（一个或多个）五、人工染色体克隆载体五、人工染色体克隆载体1、酵母人工染色体、酵母人工染色体染色体染色体（ Chromosome ）的结构元件的结构元件着丝粒着丝粒端粒（两个）端粒（两个）具

42、有酵母的具有酵母的着丝粒着丝粒序列、序列、自主复制自主复制序列、序列、端粒端粒序列序列AmprMCS酵母人工染色体酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome , YAC）可接受可接受100 1000kb的外的外源源DNA片段。片段。多多克隆位点克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因标记基因YAC已成为人类基因组计划已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具和图位克隆基因的重要工具2、细菌人工染色体、细菌人工染色体(Bacteria Artificial Chromosome , BAC )细菌细胞内能自我构建复制的质粒，约细菌细胞内能

43、自我构建复制的质粒，约100kb，它它能在细菌接合时转移能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段的细菌染色体片段F因子因子可用于克隆可用于克隆100kb以上的以上的DNA片段片段基于细菌的基于细菌的育性因子育性因子（F因子）构建的载体因子）构建的载体细菌人工染色体细菌人工染色体具有质粒的特点具有质粒的特点六、几种特殊用途的克隆载体六、几种特殊用途的克隆载体1、启动子探针载体（、启动子探针载体（promoter-probe vector） 质粒载体的必备元件质粒载体的必备元件检测部件检测部件失去启动子失去启动子的标记基因的标记基因多克隆位点多克隆位点2、诱导型表达载体、诱导型表达载体（in

44、ducible expression vector ）锌结合在位于应答性基因起始位置上游的启动子序锌结合在位于应答性基因起始位置上游的启动子序列中的一个或几个金属调节元件列中的一个或几个金属调节元件(MetalregMlatory element，MRE)位点上对基因转录进行调控。位点上对基因转录进行调控。锌与锌与MTF(MRE结合转录因子，结合转录因子，MRE-binding translation factor)结合，然后转移进入细胞膜内，结合，然后转移进入细胞膜内，MTF识别识别MT基因启动子的特异序列基因启动子的特异序列MRE(Mental response elemnt，金属反应元件

45、，金属反应元件)，并与，并与DNA结合，启结合，启动基因转录。动基因转录。3、组织特异型表达载体、组织特异型表达载体（tissue-specific expression vector)rice4、反义表达载体、反义表达载体目的基因目的基因基因工程设计和操作中，被用于基因重组、基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和得到表达产物的基因改变受体细胞性状和得到表达产物的基因第三节第三节 目的基因目的基因目的基因一般为结构基因，也就是能转录目的基因一般为结构基因，也就是能转录和翻译出多肽（蛋白质）的基因。和翻译出多肽（蛋白质）的基因。一、结构基因的组成一、结构基因的组成作为个转录和翻

46、译的作为个转录和翻译的结构基因结构基因转录转录启动子启动子（Promoter）基因基因编码区编码区（encoding region）转录转录终止子终止子（ terminator）转录转录mRNA的第一个碱基，通常为的第一个碱基，通常为A，以此作为以此作为序列的序列的+1。启动子启动子DNA上上RNA聚合酶聚合酶识别识别、结合结合和和促使转录促使转录的的一段核苷酸序列一段核苷酸序列转录起始位点转录起始位点Pribnow BOXSextama Box基因编码区基因编码区起译码起译码ATG开放阅读框开放阅读框（open reading frame , ORF）终止码终止码（ TAA、TAG或或TGA

47、）能编码蛋白质的密码子，但不包括终止密码子能编码蛋白质的密码子，但不包括终止密码子提供转录停止信息的核苷酸序列提供转录停止信息的核苷酸序列转录终止子转录终止子不同类型基因组的基因组成稍有不同不同类型基因组的基因组成稍有不同1、原核生物结构基因的组成、原核生物结构基因的组成完成同类功能的多个基完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同因聚集在一起，处于同一启动子的调控之下，下游同具一个终止子，一启动子的调控之下，下游同具一个终止子，多数以多数以操纵子操纵子形式存在形式存在不同基因分别有起译码不同基因分别有起译码ATG和终止码和终止码TAA（TAG或或TGA）。）。保守区保守区5TTGACA3，提供

48、，提供RNA聚合酶识别的信号聚合酶识别的信号原核生物的启动子原核生物的启动子Pribnow BOXSextama Box-35序列序列（Sextama框）框）保守区保守区5TATAAT3，DNA双链从此解开转录双链从此解开转录-10序列序列（Pribnow框）框）除启动子外，往往还有一些调控转录的其他因子，如除启动子外，往往还有一些调控转录的其他因子，如乳糖操除启动子乳糖操除启动子(Promoter)，还有调节因子还有调节因子(Regulator)和和操纵基因操纵基因(Operator)。操纵子操纵子原核生物基因在原核生物基因在起译码起译码的的ATG上游约上游约4-13 处，处，有一富含嘌呤核

49、苷酸的序列保守序列有一富含嘌呤核苷酸的序列保守序列SD（Shine-Dalgarno）序列）序列一般为一般为AGGA，由此区转录的序列是由此区转录的序列是翻译时翻译时核糖识别核糖识别、结合结合mRNA的位置的位置核糖体由此位置向前移动，寻找起始码核糖体由此位置向前移动，寻找起始码AUG原核生物基因转录终止原核生物基因转录终止之前之前有一段有一段回文序回文序列列（反向重序列，（反向重序列，Palindrome)终止子终止子使使RNA聚合酶减缓移动或停止聚合酶减缓移动或停止RNA的合成的合成但不是所有的回文结构都是终止子。但不是所有的回文结构都是终止子。强终止子强终止子依赖蛋白质辅助因子（依赖蛋白

50、质辅助因子（因子）因子）辅助因子称为释放因子辅助因子称为释放因子不依赖蛋白质辅助因子（不依赖蛋白质辅助因子（因子）因子）弱终止子弱终止子真核生物染色体基因组的基因真核生物染色体基因组的基因是是单独存在单独存在编码序列编码序列2、真核生物结构基因的组成、真核生物结构基因的组成两个基因间有很长的间隔序列区两个基因间有很长的间隔序列区内含子内含子起译码与终止码之间除起译码与终止码之间除编码区外还有一个至多编码区外还有一个至多个非编码序列间隔区个非编码序列间隔区外显子外显子卵清卵清蛋白基因蛋白基因-30序列序列TATA box+Inr序列序列起始子（起始子（initiator）真核生物结构基因的转录真

51、核生物结构基因的转录启动子启动子polymerase II核心核心启动子启动子DNA双链在此开始解开双链在此开始解开通常是含通常是含3个保守区个保守区TATA框（框（-20至至-30序列区）序列区）与与RNA聚合酶结合有关聚合酶结合有关CAAT框框（-75序列区）序列区）在更上游，某些转录在更上游，某些转录调控因子结合的序列调控因子结合的序列GC框框polymerase II启动子启动子真核生物基因真核生物基因终止码终止码序列序列下游下游有一保守的有一保守的AATAAA序列序列提供转录产物的释放信号提供转录产物的释放信号转录释放信号转录释放信号 “帽子帽子”7甲基鸟苷酸结构甲基鸟苷酸结构真核生物结构基因不具有真核生物结构基因不具有SD序列区，核糖体与转录序列区，核糖体与转录的的mRNA结合靠结合靠mRNA5端添加的端添加的“帽子帽子” 结构结构转录后在转录后在3端添加端添加ployA尾尾polymerase III启动子启动子RNA聚合酶