面上项目—填报说明与撰写提纲

1、报告正文请勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；1.1 项目研究的意义、国内外研究现状及发展动态过度的应激刺激不仅可以显著影响畜禽的生长、发育、免疫能力及生产性能，甚至还可因不良应激刺激而导致畜禽猝死，其中热应激是导致鸡只生产力下降和死亡的重要原因之一。据报道，美国每年因缺乏基本的热应激防护措施而造成的养殖业损失高达24 亿美元，其中仅禽类的养殖业损失就高

2、达1.28 亿美元。肉鸡被覆羽毛、无汗腺、生长快、皮下及腹下脂肪多，对热应激的抵抗力差，受热应激的影响，其生长速度显著下降尤为明显。当环境温度超过26时，由于饲料消耗减少，肉鸡生长速度明显变慢，尤其以生长快的大型肉鸡表现出对热应激的反应更为明显。当环境温度升高至40时，2-6 日龄小型肉鸡体重增加和饲料报酬分别为常温下饲养肉鸡的37%和57%，死亡率稍有上升；而在同样温度下，大型肉鸡则分别占19%和35%，死亡率高达43%。38 周龄肉鸡在29.4、29.4-40.6和40.6以上温度下，其死亡率分别为0%、50%和87%。自然养殖环境下，罗曼蛋鸡舍温在31以下时，日均死亡率为0.135%，在

3、34-40时为0.501%，最高时可达1.96%。舍内微环境温度不同，死亡率也不同，气温在34-40时，三层全阶梯式蛋鸡笼上层比下层温度高1，死亡率分别为44.8%和21.4%。热应激鸡在应激反应发生初期呈现出异乎寻常的高猝死现象,引发人们对生命重要器官出现急性衰竭的联想，而众多研究结果似乎也在印证着应激因素对鸡心脏的致死性损伤的猜想。动物生存过程中所应对的应激损伤及其程度虽有差异,但从原核生物到真核生物的细胞内存在一组旨在修复损伤的具有高度保守性的保护性蛋白质-热休克蛋白（Heat shock proteins，Hsps），尽管对其确切功能还不十分清楚，但这些在进化过程中高度保守的蛋白质本身

4、就说明它们具有普遍存在的重要生理功能。虽然Hsps 在正常生理条件下也有表达，但当细胞处于紧急状态时，Hsps 可以通过增加合成以保护自身组织细胞免受不良应激原刺激所致的各种应激性损害。目前Hsps 已成为国际基础生物学、医学和环境卫生学等领域的研究热点，如在人类医学领域中Hsps 表达与心肌缺血（心肌梗死）、肿瘤发生发展规律的相关性研究十分突出，但国内外畜牧兽医领域中有关Hsps与应激损伤及应激相关疾病（猪应激综合征等）的关系及机理等研究则显著落后。多种Hsps（如Hsp90，Hsp70，Hsp27）在细胞内各种信号通路中扮演着重要作用，其中小热休克蛋白家族成员-Hsp27（HspB1）尤其

5、引人注目。除了分子伴侣这一Hsps 共有的性质之外，Hsp27 还在细胞内p38 MAPK 通路和凋亡通路之间起着桥梁作用（图1）。Hsp27 是p38 下游磷酸激酶MAPKAPK2 和MAPKAPK3 的底物。在磷酸激酶的作用下Hsp27 发生磷酸化，从大分子多聚体解离为小分子寡聚体，进而参与细胞凋亡通路的调节。在细胞凋亡的调节中，Hsp27 可以结合cyt C，阻止其与Apaf-1 发生结合，进而抑制caspase 9 和caspase 3 的活化而发挥抗凋亡作用；Hsp27 还可直接作用于caspase 3 而抑制凋亡。此外，在凋亡的死亡受体途经中，Hsp27 可以抑制死亡结构域蛋白DA

6、XX。文献报道，Hsp27磷酸化时常伴随着Hsp27 向细胞核的转移，但其在细胞核内发挥作用的具体机制尚有待研究。Hsp27 在抗肿瘤、抗应激损伤领域有着不可比拟的作用，许多抗肿瘤药物、抗应激手段都不同方式地以Hsp27 为靶点，只是Hsp27 发挥作用的许多现象和机理还无法以现有理论进行解释。图1 Hsp27（HspB1）处于p38MAPK 通路和凋亡通路之间的位置Hsp27 在胞内信号转导中发挥的作用显然与其翻译后修饰，特别是磷酸化修饰有着密不可分的关系。研究发现，鸡的Hsp27 的磷酸化往往发生在丝氨酸15、78 和82 位上（图2）。其中，Ser15 位上的磷酸化作用尚不明确，而Ser

7、78/82位上的磷酸化与Hsp27 多聚体的解离有关。有关Hsp27 磷酸化抑制剂和激动剂有很多，作用位点也不尽相同，如SB203580 是最常用的Hsp27 磷酸化抑制剂之一，它通过抑制p38 MAPK 活性进而抑制下游磷酸激酶活性，最终抑制Hsp27 磷酸化。水杨酸钠是阿司匹林（乙酰水杨酸钠）的代谢产物，多将其作为p38 通路激活剂使用。我们实验室曾一度利用阿司匹林作为抗热应激保护剂，推测其保护作用可能与其激活p38 通路、进而激活Hsp27 磷酸化有关。这些通路激活剂和抑制剂无疑为研究Hsp27 磷酸化修饰的作用提供了便利，因此，进一步寻找Hsp27 在热应激前后，其在细胞核-细胞质之间

8、翻译后修饰位点的差异，无疑对深入探索应激损伤机理、提出切实可行的抗热应激损伤方案等产生极其深远的理论和实践意义。图2 鸡Hsp27 存在多处翻译后修饰位点，磷酸化修饰主要发生在丝氨酸15,7,82 位上准确研究各种Hsps 在信号通路中发挥作用的前提是建立一个可靠地实验模型。在体动物模型易受到多种因素影响，实际操作过程中的意外应激等都将对实验结果造成严重影响。而体外细胞模型可控性强，便于重复，在基础性的通路研究中有着不可替代的优势。依照心肌细胞可能是造成应激动物猝死的主要原因之一的观点，我们拟在本试验中选用我们实验室建立起来的永生化鸡心肌细胞系替代过去的原代培养的心肌细胞作为细胞模型开展工作。

9、同时，随着 RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术日益成熟，我们通过特异性短发夹RNA（shRNA）干扰目的蛋白的手段，再通过慢病毒包装，将干扰基因整合进靶细胞的基因序列中，实现对目的蛋白的持续干扰，构建特定Hsps 缺失的模式细胞，为探讨Hsps 在热应激状态下鸡心肌细胞中的保护作用及其在信号通路中的作用打下基础。1.2 相关领域研究取得突破的机遇和工作假说在本实验室多年来的研究中，我们探索了HSPs 家族中多个成员（B-crystalline，Hsp27，Hsp47，Hsp60，Hsp70，Hsp90）在热应激过程中转录和翻译的变化规律，分别比较了畜禽体内、外不同组织

10、中Hsps 表达水平随应激时间发生变化的规律，建立了检测不同动物体内、外Hsps mRNA 转录、蛋白表达水平，定位以及热应激损伤研究的实验技术平台。在猪、鸡应激性损伤研究方面发表了多达60 余篇文章，其中SCI 源论文30 余篇。这些研究为进一步探索热应激发生、发展机理，寻找抗应激损伤措施奠定了良好的理论基础。在新近的研究中，我们更是尝试使用不同的Hsps 诱导剂（如阿司匹林），探讨Hsps 诱导剂在保护心肌细胞免受热应激损伤及其潜在抗热应激作用。我们的研究证实，阿司匹林作为一种抗应激损伤药物，在显著降低心肌细胞热应激损伤的同时，还具有影响一系列Hsps（如Hsp27，Hsp90 等）表达水

11、平发生变化的现象，且总体上呈现出Hsps 高表达伴随细胞应激性损伤的降低或者Hsps 表达降低往往出现细胞损伤程度加大。由此我们认为，阿司匹林作为一种非甾体抗炎药（NSAIDs），其潜在抗应激作用与其诱导的各种或者部分Hsps 高表达的能力具有密不可分的联系，然而其中的具体机制尚未可知。据报道，阿司匹林对p38 通路具有激活作用，甚至被直接用作p38 MAPK 通路的激活剂。然而，Hsps 中的一个特殊成分-Hsp27 则恰好处在p38 MAPK 通路的下游，是MAPKAPK2、MAK3、PKC、Akt 等多种磷酸激酶的底物。Hsp27 具有多重细胞保护作用，一方面其在细胞质中形成80 kDa

12、 的大分子多聚体，集合并稳定骨架蛋白，发挥分子伴侣的作用；另一方面，它在MAPK 下游多种磷酸激酶的作用下发生翻译后修饰，在多处丝氨酸位点发生磷酸化，进而从大分子多聚体解离成小分子寡聚体而发挥抑制细胞凋亡的作用。由此，我们有理由推测阿司匹林保护心肌细胞抵抗热应激损伤机理之一可能与影响Hsp27 表达相关。为此，我们拟通过研究阿司匹林诱导体外培养细胞中Hsp27 表达量改变、Hsp27 翻译后修饰对抗热应激损伤的作用、Hsp27 对重要器官的组织细胞（心肌）抗热应激损伤及动物应激性猝死发生中的意义、阿司匹林能否通过抑制/激活某信号通路来调控Hsps 活性并进而降低热应激损伤等，有望在阐明应激性损

13、伤与Hsps 的关系，应激损伤与特定Hsps 翻译后修饰的关系，应激性疾病发生机理研究以及提出抗应激措施等方面取得重要理论和实验成果。主要参考文献1，Jimian Yu, Endong Bao，Jianyan Yan, Lei Lei. Expression and localization of Hsps in theheart and blood vessels of heart stressed broilers，Cell stress and Chaperone，2008，13（3）：327-335.2，Jimian Yu, Endong Bao. Effect of acute he

14、at stress on heat shock protein 70 and itscorresponding mRNA expression in the heart, liver, and kidney of broilers ，Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2008，21(8):1116-1126.3，Lin Zhu, Endong Bao, Ruqian Zhao, Jörg Hartung, Expression of heat shock protein 60 inthe tissues of transpor

15、ted piglets, Cell stress and Chaperone，2009，14（1）：61-69.4，Jianyan Yan, Endong Bao, Jimian Yu. Heat shock protein 60 expression in heart, liver andkidney of broilers exposed to high temperature, Research in Veterinary Science，2009，86（3）：533-538.5，Qingqing Hao, Endong Bao, Miao Zhang, Zhenhua Yue, J&#

16、246;rg Hartung, Variation in theexpression of Hsp27, Hsp70, Hsp90 and their corresponding mRNA transcripts in the heartsof pigs during different transportation durations. Livestock Science，2010，129: 8894.6，Miao Zhang，Lingxiang Xin, Endong Bao*, Jörg Hartung, Zhenhua Yue，Variation in theexpressi

17、on of Hsp27, aB-crystallin mRNA and protein in heart and liver of pigs exposed todifferent transport times，Research in Veterinary Science，2011，90（3）：432-438.7, Zhijun Liu, Yingjun Lv, Miao Zhang, Zhenhua Yue, Ali Islam, Buriro Rehana, Tang shu,Endong Bao*, Jörg Hartung，Hsp110 expression changes

18、 in rat primary myocardialcells exposed to heat stress in vitro，Genetics and Molecular Research，2012，11（4）:4728-4738.8, J. Acunzo, M. Katsogiannou, and P. Rocchi, Small Heat Shock Proteins Hsp27 (Hspb1),Alphab-Crystallin (Hspb5) and Hsp22 (Hspb8) as Regulators of Cell Death, Int J BiochemCell Biol,

19、2012，44, 1622-31.9, M. Katsogiannou, C. Andrieu, and P. Rocchi, Heat Shock Protein 27 Phosphorylation StateIs Associated with Cancer Progression, Front Genet, 2014，5, 346.10, S. Kostenko, and U. Moens, Heat Shock Protein 27 Phosphorylation: Kinases, Phosphatases,Functions and Pathology, Cell Mol Lif

20、e Sci, 66 (2009), 3289-307.11, D. Lanneau, G. Wettstein, P. Bonniaud, and C. Garrido, Heat Shock Proteins: CellProtection through Protein Triage, ScientificWorldJournal, 2010，10, 1543-52.12, X. Sui, N. Kong, L. Ye, W. Han, J. Zhou, Q. Zhang, C. He, and H. Pan, P38 and Jnk MapkPathways Control the Ba

21、lance of Apoptosis and Autophagy in Response toChemotherapeutic Agents, Cancer Lett, 2014，344, 174-9.13, F. Xu, T. Yang, D. Fang, Q. Xu, and Y. Chen, An Investigation of Heat Shock Protein 27 andP-Glycoprotein Mediated Multi-Drug Resistance in Breast Cancer Using LiquidChromatography-Tandem Mass Spe

22、ctrometry-Based Targeted Proteomics, J Proteomics,2014，108, 188-97.14, X. Sui, N. Kong, L. Ye, W. Han, J. Zhou, Q. Zhang, C. He, and H. Pan, P38 and Jnk MapkPathways Control the Balance of Apoptosis and Autophagy in Response toChemotherapeutic Agents, Cancer Lett, 2014，344, 174-9.15, F. Xu, T. Yang,

23、 D. Fang, Q. Xu, and Y. Chen, An Investigation of Heat Shock Protein 27 andP-Glycoprotein Mediated Multi-Drug Resistance in Breast Cancer Using LiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry-Based Targeted Proteomics, J Proteomics,2014，108, 188-97.2项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）；2.1 研究内容2.1.1

24、鸡心肌细胞原代培养条件的优化和永生化细胞系的建立：在实验室曾经建立的鸡心肌细胞原代培养方法基础上，使用胶原酶I 冷消化，37差速贴壁，Brdu 抑制成纤维细胞有丝分裂纯化心肌细胞等措施，优化原代细胞培养方法。在原代鸡心肌细胞基础上，使用SV40T 病毒转染法、端粒酶逆转录蛋白（TERT）导入法、变体抑癌基因法，对获取的原代细胞进行永生化处理，获得能够稳定传代的永生化鸡心肌细胞系。2.1.2 特定Hsps 低表达细胞模型的构建在已建立的鸡心肌细胞系基础上，采用慢病毒包装的shRNA 转染该细胞系，通过shRNA 干扰方式，分别沉默Hsp27，获得能够持续低表达Hsp27 的模式细胞。2.1.3

25、特定Hsps 缺失对热应激造成的鸡心肌细胞表观损伤、凋亡的影响。对Hsp27 低表达的心肌细胞和正常心肌细胞分别进行热应激处理。收集细胞上清，检测心肌细胞特异性酶谱变化、氧化损伤与能量代谢酶谱变化。制作细胞爬片，通过HE 染色观察热应激过程中两种鸡心肌细胞的应激性病理损伤情况。用Annexin V-FITC/PI 染色后，通过流式细胞仪检测热应激造成的心肌细胞凋亡情况。收集细胞样品，用试剂盒检测caspase-3,-8,-9 活性来进一步反应热应激造成的细胞凋亡及其水平，探讨心肌细胞凋亡的通路。2.1.4 Hsp27 过表达细胞模型的构建通过PCR 扩展获得Hsp27 基因片段，与真核细胞表达

26、载体进行克隆连接，再用大肠杆菌感受态进行转化，调取阳性单克隆酶切鉴定并测序，确定Hsp27基因没有发生突变。随后大量制备阳性克隆，使用除内毒素质粒提取试剂盒提取纯化的质粒DNA。再使用转染试剂（脂质体或者阳离子聚合物）包裹线性化的质粒DNA 转染细胞。根据载体的抗性使用药物加压筛选单克隆细胞株，再通过Western Blot 检测目的蛋白是否过表达，从而获得过表达特定Hsp27 的细胞株。2.1.5 Hsp27 过表达细胞株在热应激状态下的细胞凋亡以及病理损伤情况通过热应激Hsp27 过表达细胞株、基因缺失细胞株以及正常细胞株在各项上述损伤指标以及凋亡通路蛋白的对比，比较分析Hsp27 在热应

27、激鸡心肌细胞中的作用。2.1.6 Hsp27 翻译后修饰及其抵抗热应激损伤、抗细胞凋亡中的作用本课题拟以Hsp27 的磷酸化修饰为突破，研究Hsp27 磷酸化对热应激造成的鸡心肌细胞表观损伤、凋亡的影响。使用阿司匹林作为激活剂作用于心肌细胞，调节心肌细胞内Hsp27 磷酸化水平的高低，并用WB 进行验证。分别对经不同处理后，具有高磷酸化水平的Hsp27、低磷酸化水平的Hsp27 和正常磷酸化水平的Hsp27 心肌细胞进行热应激处理。收集心肌细胞上清液和细胞，检测心肌细胞特异性酶谱变化、氧化损伤与能量代谢酶谱变化。制作细胞爬片，通过HE染色观察热应激过程中鸡心肌细胞的表观损伤情况。用Annexi

28、n V-FITC/PI 染色后，通过流式细胞仪检测热应激造成的心肌细胞凋亡情况。收集细胞样品，通过试剂盒检测caspase-3,-8,-9 活性来进一步反应热应激造成的细胞凋亡水平，并根据不同caspase 酶活性来探讨激活的细胞凋亡通路。2.1.7 探讨热应激条件下引起的Hsp27 其他翻译后修饰位点的变化对细胞进行热应激处理，分别提取胞浆、胞核蛋白，通过双向电泳，液相色谱串联质谱的方法分析Hsp27 在热应激前后，其他修饰位点的变化及胞核-胞质间的变化。探讨Hsp27 在细胞核内的作用。2.1.8 探讨Hsp27 变化与心肌细胞应激性病理损伤的相关性及其机理依据上述实验结果，分析讨论阿司匹

29、林抵抗心肌细胞热应激损伤机理，以及与Hsp27 表达及Hsp27 磷酸化修饰的关系，为临床抗应激措施的提出奠定良好理论和实验依据。2.2 研究目标2.2.1 建立可稳定传代的永生化鸡心肌细胞系，以及Hsp27 缺失的鸡心肌细胞系和Hsp27 过表达的鸡心肌细胞系。为体外热休克蛋白与信号通路、翻译后修饰关系研究提供实验平台。2.2.2 研究Hsps 在应激损伤中的地位，研究Hsp27 翻译后修饰在抗热应激损伤中的作用。2.2.3 探索阿司匹林抗热应激损伤机理以及与Hsp27 翻译后修饰的关系。2.2.4 为动物抗应激损伤措施的提出提供理论和实验依据。2.2.5 培养博士研究生3 名和硕士研究生2

30、 名。2.3 拟解决的关键问题2.3.1 由于研究过程中所使用到的细胞量较大，对成批量心肌细胞的需求和要求较高，同时心肌细胞培养过程中易受到众多环境应激原的影响，造成对Hsps表达分析工作的困难。因此，应激实验环境条件、参照比对的控制尤为关键。但据现有的工作基础和实验条件，有信心能解决。2.3.2 Hsps 检测方法和计算机图形分析技术为本试验的关键环节，但均为本实验室已经建立的常用检测技术，相关人员具备娴熟的操作技能。因此，本项目检测方法的建立不成问题。2.3.3 Hsp27 诱导剂处理后心肌细胞对热应激的反应，探讨Hsp27 在心肌细胞热应激过程中的变化规律，综合分析、阐明应激过程中Hsp

31、s 表达及其翻译后修饰与组织细胞损伤以及损伤程度之间的关系，是本项目面临的重要挑战。3拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）；3拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）；3.1 研究方法、关键技术和可行性分析3.1.1 原代鸡心肌细胞培养和永生化心肌细胞系的建立取12 14 日龄的SPF 鸡胚，切取心尖组织、清洗、破碎、胶原酶I 消化。通过差速贴壁的方法分离心肌细胞和成纤维细胞，在含Brdu 的培养基中对分离所得的心肌细胞进行培养，获取原代心肌细胞。本实验拟使用SV40T 病毒转染法、端粒酶逆转录蛋白（TERT）

32、导入法、变体抑癌基因法等，对原代心肌细胞进行永生化处理。通过进行药物筛选，qRT-PCR鉴定转染基因，最终获得能够稳定传代的永生化鸡心肌细胞系（图3）。图3 SV40T 构建永生化细胞流程图上述细胞永生化方法已在人、鼠等多种动物的原代细胞永生化中得到应用，技术成熟，甚至已有商业化试剂盒出售，因此技术上是切实可行的，本实验室已经初步获取永生化的鸡心肌细胞，目前需要对培养技术进行适度改良。3.1.2 特定Hsps 低表达细胞模型的构建在上述建立的鸡心肌细胞系的基础上，拟采用慢病毒包装的shRNA 转染该细胞系，旨在通过shRNA 干扰方式，分别沉默特定Hsps（Hsp27），获得能够持续低表达某热

33、休克蛋白（Hsp27）的细胞系。从GeneBank 网站上查找鸡源Hsp27 的DNA 序列，由此设计并人工合成shRNA序列。将合成好的shRNA 导入感受态细胞，筛选、扩增、提取质粒，进行测序验证。将构建的载体、包装系统共转染病毒包装细胞293T，培养 48 h 72 h，收集含有病毒的上清培养液。纯化和浓缩病毒，测定病毒滴度，检验目的基因后，分装，转染细胞。转染后的细胞，通过WB 验证Hsp27 含量，检验沉默效率。3.1.3 特定Hsps（Hsp27）过表达细胞模型的构建在上述建立的鸡心肌细胞系的基础上，拟采用构建含有特定Hsps（Hsp27）基因的真核细胞表达载体转染该细胞系。获得能

34、够过表达Hsp27 的细胞系。通过PCR 扩增获得Hsp27 基因片段，与真核细胞表达载体进行克隆连接，再用大肠杆菌感受态进行转化，挑取阳性单克隆提取质粒进行酶切鉴定并测序，确定Hsp27 基因没有发生突变。大量制备阳性克隆，使用除内毒素质粒提取试剂盒提取纯化的质粒DNA。再用转染试剂（脂质体或者阳离子聚合物）包裹线性化的质粒DNA 转染细胞。根据载体的抗性使用药物加压筛选单克隆细胞株，再通过Western Blot 检测目的蛋白是否过表达，从而获得过表达Hsp27 的细胞株。3.1.4 Hsps（Hsp27）缺失对热应激造成的鸡心肌细胞表观损伤、凋亡的影响对特定Hsps（Hsp27）低表达、

35、高表达和正常心肌细胞分别进行热应激处理，收集细胞上清，检测心肌细胞特异性酶谱变化、氧化损伤与能量代谢酶谱（SOD，ATP，GSP，MDH，SDH，CK-MB，CK，LDH）变化。制作细胞爬片，通过HE 染色观察热应激过程中鸡心肌细胞的表观损伤情况。用无EDTA 胰酶消化细胞、Annexin V-FITC/PI 染色后，通过流式细胞仪检测热应激造成的心肌细胞凋亡情况。收集细胞样品， 通过试剂盒检测caspase-3,-8,-9 活性来进一步反应热应激造成的细胞凋亡，并根据不同caspase 活性来探讨潜在激活的细胞凋亡通路。3.1.5 Hsp27 翻译后修饰在热休克蛋白抵抗热应激损伤、凋亡中的作

36、用通过Hsp27 磷酸化抑制剂CID755673 处理心肌细胞；通过阿司匹林（20 mM）处理，使p38 活化进而激活下游Hsp27 磷酸化。WB 检测不同处理后Hsp27 磷酸化水平。分别对具有高磷酸化水平Hsp27、低磷酸化水平Hsp27 和正常磷酸化水平Hsp27 的心肌细胞进行热应激处理。收集细胞上清，检测心肌细胞特异性酶谱变化、氧化损伤与能量代谢酶谱（SOD，ATP，GSP，MDH，SDH，CK-MB，CK，LDH）变化。制作细胞爬片，通过HE 染色观察热应激过程中鸡心肌细胞的损伤情况。用无EDTA 胰酶消化细胞、Annexin V-FITC/PI 染色后，通过流式细胞仪检测热应激造

37、成的心肌细胞凋亡情况。收集细胞样品， 通过试剂盒检测caspase-3,-8,-9 活性来进一步反应热应激造成的细胞凋亡，并根据不同caspase 活性变化来探讨潜在激活的凋亡通路。3.1.6 探讨热应激引起的Hsp27 翻译后修饰位点的变化对细胞进行热应激处理，分别提取胞浆胞核蛋白，通过双向电泳，液相色谱串联质谱的方法分析Hsp27 在热应激前后其修饰位点的变化以及胞核胞质间的变化，并以其探讨Hsp27 在细胞核内的作用。3.1.7 探讨Hsps 变化与心肌细胞应激性病理损伤变化的相关性及其机理依据上述研究结果，分析、探讨阿司匹林抵抗心肌细胞热应激性病理损伤的机理、Hsp27 表达与Hsp2

38、7 磷酸化修饰的关系，为临床抗应激措施的提出奠定良好理论和实验依据。3.1.8 本实验可行性本实验室在以往的研究中，对热休克蛋白的表达谱进行了系统研究，对多种Hsps（Hsp27,Hsp47,Hsp60,Hsp70,Hsp90,Hsp110）在热应激过程中的表达水平随时间而发生变化的规律进行了长期的研究。本实验中所使用的众多技术手段、研究平台为本实验的顺利进行提供了坚实保障，尤其是我们初步建立并获取的永生化鸡心肌细胞为本实验的开展提供了坚实平台。本实验室研究人员具有娴熟的实验操作技能，获取预期的研究目标有保证。3.2 技术路线4本项目的特色与创新之处；4.1 研究思路目前，无论是信号通路及翻译

39、后修饰、原代细胞永生化、shRNA 干扰技术或蛋白过表达技术均集中于哺乳动物中，而在禽类研究中的应用十分稀少。本研究将这一系列新技术平台引入禽类热应激领域的研究中具有明显的创新性，在国内外同行中处于先进水平。另外，本实验室在以往的研究中发现，通过阿司匹林预处理后，体内、外热应激损伤的发生程度与一些Hsps 的表达存在相关性。因此，我们拟通过siRNA 沉默特定Hsps，构建鸡心肌模式细胞，进而系统地探索Hsp27 抵抗热应激的细胞分子机制，为以后综合研究其他Hsps 表达及翻译后修饰在抗应激损伤中的作用，并最终为实际生产中预防和治疗应激性病理损伤提供理论指导。4.2 研究层面在体动物中进行应激

40、影响研究均不可避免的存在个体差异大、易受外界干扰等不利因素左右。而在细胞模型上进行应激性损伤研究也缺乏商品化的鸡心肌细胞系，况且原代鸡心肌细胞的培养不仅成本高、耗时长，也难以获取足够的细胞数量。而本研究中我们通过本实验室建立起来的永生化鸡心肌细胞进行原代培养，在质量稳定的细胞系上进行细胞和分子水平上的抗应激损伤分子机理研究，利用特定Hsps 缺失的模式细胞对后续研究均有重要意义。4.3 研究技术通过细胞永生化技术构建试验用细胞系，通过慢病毒包装siRNA 干扰技术沉默特定Hsps，构建稳定的模式细胞。利用蛋白表达检测技术、心肌细胞特异性酶谱变化、细胞凋亡特异性酶活变化、流式细胞检测技术、免疫电

41、镜技术等先进手段综合研究，可减少原有检测手段限制样本量而导致的误差及主、客观干扰因子给实际分析工作带来的困难和偏差，使Hsps 诱导表达改变与细胞应激性损伤的研究更具客观性。5年度研究计划及预期研究结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）。5.1 研究计划:本计划研究的时间年限为4年(2016年01月-2019年12月)，具体计划拟定为：第一年（2016年01月-12月）：1.鸡心肌细胞原代培养及永生化细胞系的建立与优化。2.siRNA干扰特定Hsps表达及特定Hsp27缺失模式细胞的建立。3.热应激处理及样品收集，按预定方案检测细胞的表观损伤、凋亡等改变。第二年（2017年

42、01月-12月）：1.Hsp27磷酸化抑制剂和激动剂处理后细胞样品的收集。2.对不同Hsp27磷酸化水平的细胞样品进行热应激处理，收集样品，检测细胞的表观损伤、凋亡的发生变化规律。第三年（2018年01月-12月）：1.液相色谱串联质朴法进一步研究应激过程中Hsp27翻译后修饰的变化。2.利用生物信息学分析技术，研究不同Hsp27磷酸化水平的模式细胞在热应激过程中变化规律及分子调节机制。第四年（2019年01月-12月）：1.分析Hsps过表达在应激过程中保护机制。2.试验收尾、数据整理、论文撰写、课题总结等。5.2 学术交流活动、国际合作与交流计划（1）课题组成员参加相关的国内、国际会议，交

43、流本项目的研究成果。（2）2016年-2019年期间，拟邀请德国相关问题研究专家2人次来华讲学或合作研究；派遣课题组成员2人次到德国汉诺威兽医大学参加与本课题相关的合作研究。5.3 预期研究成果（1）通过离体培养鸡心肌细胞进行抗应激反应研究，阐明应激性病理损伤与特定Hsps的关系，为应激性疾病和应激相关性疾病的发病机理研究以及提出抗应激措施等提供理论和实验依据。（2）建立永生化鸡心肌细胞研究平台。利用siRNA干扰特定Hsps表达，建立特定Hsps缺失模式细胞，为后续研究提供支持。（3）主要研究成果以论文方式发表,在国际和国内核心刊物上发表研究论文8篇(其中国际刊物上发表6篇)。（4）培养博士

44、研究生2名、硕士研究生2名。（二）研究基础与工作条件1研究基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）；（1）课题主持人曾主持过国家自然科学基金项目“猪、鸡应激蛋白和畜禽应激损伤发病机理的研究（39770569）”、“持续热应激状态下鸡应激蛋白表达规律与应激损伤机理（30170682）”、“应对生物逆境的鸡hsps mRNA 转录、Hsps表达及应激损伤相关性（30571400）”、“运输应激猪热休克蛋白表达规律及应对应激损伤的分子机制（30972165）”、农业部公益性行业（农业）科研专项子项目“家畜生产运输过程中环境应激响应及调控技术研究（201003060-11）”和中德农业

45、科技合作项目“环境应激与应激损伤”的研究工作，积累有丰富的第一手研究材料并具备较完整的实验材料，以往的研究基础和条件可直接应用于本项目并为本项目的完成提供坚强支持。目前我们在肉鸡热应激、猪运输应激与应激损伤领域的生物学和兽医学国际期刊发表SCI 收录的论文30 余篇，为应激性疾病和应激相关性疾病的发病机理研究奠定了良好的基础。（2）本实验室和德国汉诺威兽医大学动物卫生和动物福利研究所就应激和应激损伤研究建立了长达15 年的长期合作关系，德方也将为本项目的顺利进行提供一定的技术、实验条件上的支持。（3）本实验室长期从事畜禽分子病理学和免疫病理学研究，具有丰富的实践经验和研究的条件。（4）本实验室

46、具有涉及Hsps 研究的娴熟技术人员和博士、硕士研究生多名，可保障研究工作的顺利完成。2工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况）；(1)本研究以所在学科的农业部动物生理生化重点实验室农业部动物疫病诊断与免疫控制重点实验室为依托来完成。多年来本学科点承担了国家和省部级多项科研课题的研究工作，建立（掌握）了与本项目相关的多种分子生物学、生物化学、细胞生物学、免疫学、组织学等实验方法。拥有病理学、免疫学、组织学、细胞生物学（DNA 和RNA）、色谱、电泳、生化、生理机能等专门实验室。主要可供操作利用

47、的实验设施还有完善的试验动物房、荧光定量PCR 仪、多功能显微镜、高速离心机、冰冻及石蜡切片机、计算机图像分析系统、多功能电泳仪、薄层层析扫描、紫外分光光度计、CO2 培养箱、细胞和凝胶计算机图象分析系统、杂交炉等。校中心实验室的大型设备也可供本项目使用。（2）本实验室与德国合作者建立的长期合作关系，有利于我们借助国外的先进设备和技术，可使我们的研究工作水平达到国际先进水平，德方将为本项目的顺利进行提供一定的技术、实验条件上的支持。（3）因有些实验用药械、必备的进口试剂、试验动物和众多的管理费用等需要一定的基金资助和维持。拟争取获得本基金项目的资助以及实验室其它渠道科研资金的资助和相互利用。3

48、正在承担的与本项目相关的科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担的与本项目相关的科研项目情况，包括国家自然科学基金的项目和国家其他科技计划项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）；（1）“热休克蛋白过表达抵抗心肌应激损伤的分子机制”（31372403），国家自然科学基金，2014-2017，该项目为本申请项目的前期积累性研究，可为后续性研究提供必要支持。（2）“家畜生产运输过程中环境应激响应及调控技术研究”，农业部公益性行业（农业）科研专项子项目（201003060-11），2010-2014，鲍恩东为该子项目的主持人。该项目主要在活体动物（猪）开

49、展应激与抗应激损伤研究，关注重点在运输应激猪的抗应激措施研究，除研究技术手段外，与本申请项目无直接关系。4完成国家自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）。4.1 项目简况申请人主持的前一个国家自然科学基金项目“运输应激猪热休克蛋白表达规律及应对应激损伤的分子机制”，2010-2012，批准号为30972165，目前已经顺利完成结题工作。4.2 工作总结摘要本研究选取皮特兰和二花脸杂交二代仔猪20 头，随机分成4 组，一组作为对照组

50、饲养在正常饲养环境中，其余三组在常规路段分别进行1 h、2 h 和4 h 的运输。运输结束后，剖杀所有运输组和对照组猪，分离血清，检测血清生化指标丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）。采取心脏、肝脏、胃和背最长肌，用于组织病理学检测、ELISA 和荧光定量RT-PCR 研究。结果显示，运输应激后心脏实质细胞表现出以急性退行性变化为主要特征的急性损伤。心脏和肝脏细胞的损伤在运输1 h 后最明显，Hsp27 和B-crystallin 的表达在猪的运输过程中显示出了组织特异性。运输应激后猪胃脏黏膜皱褶上的主细胞有不

51、同程度的脱落，运输2 h 后，胃组织中的Hsp90 表达量显著下降,但经过1 h、2 h 和4 h 运输后，各组猪胃脏中Hsp70 水平均显著高于对照组。胃中B-crystallin 的表达在运输4 h 后显著高于对照组。调节HSPs 表达的HSF-1 的水平在运输过程中基本保持稳定，提示在运输应激过程中，HSF-1 不是调节HSPs 表达的唯一因素。该项目结束至今已经在SCI 源收录期刊发表了署名该项目资助标记的文章8 篇（其中2 篇已被接受）。4.3 项目后续发展与本申请项目的关系尽管我们在以往的研究中进行了长期和大量的工作，但这些工作对象选择了对热敏感的动物肉鸡和对运输敏感的动物猪作为实

52、验动物模型，鉴于目前对Hsp的认识水平、试验研究手段和条件等限制，造成我们对Hsps及其hsps mRNA在整体动物组织细胞中表达研究易于受到环境因素的影响,从而造成研究结果往往出现偏差和缺乏强有力的证据。如果不能有效比较应激反应前后Hsp表达量的动态变化规律、比对处于大环境下的整体与微环境下个体细胞对应激原刺激的反应、了解组织细胞内Hsp调控规律等，将明显影响Hsp表达改变与应激损伤机理的揭示。如果能够将研究对象受到环境因素影响的程度降至最低，再辅以具有良好重现性、扩大检测样本量等先进实用手段，则可以有效弥补以往样本不足以及环境变量影响而造成的试验误差等缺憾。继续深入把握这种方法的各个环节，

53、利用我们已经成功建立的检测手段对异常状态下离体培养心肌细胞中构成型和诱导型Hsps及其相应hsps mRNA动态变化规律、Hsps表达水平与心肌细胞应激性病理损伤程度等进行联合比对分析，将使Hsp表达规律和抗应激损伤机理的认知提高到新的高度，对深入揭示Hsp细胞保护作用机理提供重要理论依据。因此，本项目在以往研究基础上，着眼于集中研究应激环境下离体培养心肌细胞内诱导型Hsps动态变化规律的分析，可实现从分子、细胞水平上探讨应激状态下心肌细胞对抗应激损伤的机理，拓宽Hsp的研究领域。4.4 相关成果目录1，Qingqing Hao, Endong Bao*, Miao Zhang, Zhenhu

54、a Yue, Jörg Hartung, Variation in theexpression of Hsp27, Hsp70, Hsp90 and their corresponding mRNA transcripts in the heartsof pigs during different transportation durations. Livestock Science，2010，129: 8894.2，Zhenhua Yue，Qingqing Hao，Shu Tang，Endong Bao*, Jörg Hartung, Variation in Hsp90

55、,HSF-1, and hsp90 mRNA expression in tissues of pigs exposed to different durations oftransport. Livestock Science，2010，129: 141-145.3，Miao Zhang，Lingxiang Xin, Endong Bao*, Jörg Hartung, Zhenhua Yue，Variation in theexpression of Hsp27, aB-crystallin mRNA and protein in heart and liver of pigs

56、exposed todifferent transport times，Research in Veterinary Science，2011，90（3）：432-438.4，Miao Zhang, Yingjun Lv, Zhenhua Yue, Ali Islam, Buriro Rehana, Endong Bao*, JörgHartung, Effects of transportation on expression of Hsp90, Hsp70, Hsp27, andB-crystallin in the pig stomach，Veterinary Record，2011，169: 312.5，Miao Zhang, Zhenhua Yue, Zhijun Liu, Ali Islam, Buriro Rehana, Shu Tang, Endong Bao,Jörg Hartung，Hsp70 and HSF-1 expression is altered in the tissues of pigs transportedfor various periods of times，Journal of Veterinary Science，2012，13(3),