色谱法原理与应用- 3

1、1色谱法Chromatography2色谱技术的创始人色谱技术的创始人茨维特（茨维特（1872191918721919） 他在研究中观察到他在研究中观察到石油醚极易溶解离析态的叶绿素和相关色素，但不能直接从植物叶中提取出色素.乙醇(甚至在其它溶剂中加入少量乙醇)则很容易直接提取出植物叶中的色素。 3茨维特的实验茨维特的实验4 色谱分离效果图5色谱法气相色谱法气相色谱法 气相色谱仪 有效测定公式 色谱柱效能 定性定量操作 分离操作的条件选择高效液相色谱法高效液相色谱法 高效液相色谱仪 高效液相色谱法分类 高效液相色谱应用毛细管电泳法毛细管电泳法6分离原理: 依据不同物质在流动相流动相中与固固定相

2、定相的相互作用的不同而产生不同的分配率分配率,经过多次分配而达到混合物的分离混合物的分离的目的。 73、色谱法的分类 按流动相状态的不同，可分为按流动相状态的不同，可分为气相色谱法气相色谱法 (GC)液相色谱法液相色谱法 (LC)超临界流体色谱超临界流体色谱 (SFC)8什么是气相色谱法？ 以气体为流动相的色谱法以气体为流动相的色谱法 Gas Chromatogaphy，简称简称GC 适合分离分析适合分离分析易汽化易汽化（在（在- 190-500范围内有范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的）的蒸气压的）稳定、不易分解、不易稳定、不易分解、不易反应反应的样品，特别适合用于的样品，特别适合用于同

3、系物、同分异构体同系物、同分异构体的的分离。分离。9GC-14CGC-3GC-4GC-7GC-9GC-14GC-17GC-8AGC-2010GC-2014气气 相相 色色 谱：谱：10气相气相色谱色谱仪仪气路气路系统系统进样进样系统系统色谱色谱柱柱温度温度控制控制系统系统检测检测器器111213气相色谱仪的常用检测器气相色谱仪的常用检测器v1.TCD（热导检测器）v2.FID（火焰离子化检测器）v3.FPD（火焰光度检测器）v4.ECD（电子捕获检测器）14热导检测器热导检测器TCD 原理：原理：气流中气流中样品浓度样品浓度发生变化，则从发生变化，则从热敏元件热敏元件上上所带走的热量也就不同，

4、从而改变热敏元件的电阻所带走的热量也就不同，从而改变热敏元件的电阻值，由于热敏元件为组成惠斯顿电桥之臂，只要桥值，由于热敏元件为组成惠斯顿电桥之臂，只要桥路中任何一臂路中任何一臂电阻发生变化电阻发生变化，则整个线路就立即有，则整个线路就立即有信号输出信号输出。特点：特点：此检测器几乎对此检测器几乎对所有可挥发的有机和无机物所有可挥发的有机和无机物质质均能响应。但灵敏度较低，被測样品的浓度不得均能响应。但灵敏度较低，被測样品的浓度不得低于万分之一。属非破坏性检测器。低于万分之一。属非破坏性检测器。15火焰离子化检测器火焰离子化检测器FIDv原理：原理：在氢氧焰的高温作用下，许多分子均将分裂为碎片

5、，并有自由基和激态分子产生，从而在氢焰中形成这些高能粒子所组成的高能区，当有机分子进入此高能区时，就会被电离，从而在外电路中输出离子电流信号。v特点：体积小，灵敏度高，死体积小，应答时间快，但对部分物质如H2、O2、N2、CO、CO2、NO、NO2、CS2、H2O等无响应。属破坏性检测器。 16火焰光度检测器火焰光度检测器FPDv原理原理:燃烧着的氢焰中，当有样品进入时，则燃烧着的氢焰中，当有样品进入时，则氢焰的氢焰的谱线和发光强度谱线和发光强度均发生变化，然后由光均发生变化，然后由光电倍增管将光度变化转变为电信号电倍增管将光度变化转变为电信号v特点特点:对对磷、硫化合物磷、硫化合物有很高的选

6、择性，适当有很高的选择性，适当选择光电倍增管前的滤光片将有助于提高选择选择光电倍增管前的滤光片将有助于提高选择性，排除干扰。性，排除干扰。 17电子捕获检测器电子捕获检测器ECD原理：原理：载气分子在63Ni辐射源中所产生的粒子的作用下离子化，在电场中形成稳定的基流，当含电负性基团的组分通过时，俘获电子使基流减小而产生电信号。特点：特点：对电负性物质（例如：卤化物,有机汞，有机氯及过氧化物，金属有机物，硝基、甾类化合物等）有很高的灵敏度。属非破坏性检测器。 18 0FtVMMMRRttt0FtVRR00)(FttFtVMRRR19峰高乘半峰宽法：适于对称峰峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰峰高乘平均

7、峰宽法：适于不对称峰峰高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。)2(85. 015. 0YYhA2/12065. 1YhAYhA1.0204RthA20R: 分离度tR: 保留时间t0：死时间W：峰底宽度2. 色谱分离效能色谱分离效能)(2121)1()2(WWttRRR21理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数理论塔板高度HETP=L/n (色谱柱长为L,塔板间距为H)理论塔板数n越大，柱效越高；理论塔板数HETP越效，柱效越高22/1)(54. 5WtnR22三、色谱定性与定量方法231. 色谱定性分析（1）纯物对照定性纯物对照定性

8、各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值， 因此保留值可作为定性指标保留值可作为定性指标。（2）文献保留值定性文献保留值定性 利用相对保留值和保留值经验定律（如沸点定律等）。（注意使用的固定液及柱温和记录值保持一致）242 色谱定量分析(1) 色谱定量基础 色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比积成正比。在一定色谱条件下有：.,是峰面积是绝对质量校正因子其中iiiiiAfAfm 25（2）定量要解决的问题）定量要解决的问题 峰面积的测量和计算 定量校正因子的测量与计算 色谱定量方法及其应用26校正因子的测量与计算 相对校正因子相对校正因子 由于绝对

9、校正因子与仪器的灵敏度有关，又由于灵敏度与实验条件相关，且每一检测器的灵敏度都是不同的，它不容易测量准确，亦无通用性，所以实际工作中使用相对校正因子相对校正因子。27相对校正因子 摩尔校正因子 siismsmimmAmAfff,isisisMsMiMMmAMmAfff,被测组分被测组分的质量的质量标准物质量标准物质量分子量分子量28定量方法 归一化法 内标法 含内标标准曲线法 外标法 含单点校正29n 校正归一化法%100%100%100)(221121nniiniifAfAfAfAmmmmmmiw推导推导：%100iiiiAfAf30应用范围应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器

10、上均有响应，各组分峰没有重叠时，可用此法。优点优点：简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。缺点缺点：对该法的苛刻要求限制了它的使用。31n 内标法推导推导 将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。ssiisiAfAfmm1001001100%,sississsiiiifmmAAmAfmAfmmC32适用范围：适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。优点：优点：受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象归一化法那样受到限制，此法适合于微量物质的分析。缺点：缺点：每次分析必须准确称量被测物和内标物，

11、不适合于快速分析。33n 外标法（标准曲线法）用于常规分析用于常规分析优点：优点：操作简单，计算方便。缺点：缺点：结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。34载气及流速载气及流速 （1）根据所用的检测器类型 如：火焰离子化检测器需用氮 气和氢气。 （2）适当提高载气流量可以缩短 时间。进样量的控制 与柱容量，固定液配比及仪器的线性响 应范围有关。柱径越粗，固定液配比越高，允许进样量越大。最大允许进样量在半峰不变的情况下，峰高与进样量呈线性关系的范围内。温度控制 受试样沸点的限制。3536（一）内装固定相的填充柱；（二）内壁涂固定液的毛细管柱固体吸附剂：适于分离永久

12、性气体和低沸点烃类。载体：由化学惰性的、多孔的固体微粒构成，要求其热稳定性好，无催化活性，孔径均匀，比表面积大，不易破碎。1. 固定液：要求沸点高，挥发性小，热稳定性和化学稳定性高，对各组分有适当的溶解能力，选择性好。37第3章 高效液相色谱法的建立与应用high performance liquid chromatography38 高效液相色谱仪的分析原理 高效液相色谱仪的结构 色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱高效液相色谱法分类 液固吸附色谱 液液分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 亲和色谱3940HPLC有以下特点 高压压力可达150300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速流速为0