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文档简介

1、考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量一、原理考马斯亮蓝 G-250 (Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质 的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm后者在595nm在一定蛋白 质浓度范围内(1-1000卩g),蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋 白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一 种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质

2、含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。二、材料、仪器设备及试剂1、材料：小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料2、仪器设备：分光光度计、研钵、烧杯、移液管3、试剂(1) 标准蛋白质溶液：100卩g -ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg 加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。(2) 考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml90%乙醇中，加入100ml 85%(W/V的磷酸，再用蒸馏水定容到1L,贮于棕色瓶中， 常温下可保存一个月。三、实验方法及步骤1、标准曲线的绘制取6支具塞试管，按表加

3、入试剂。混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白 质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。管号123456蒸馏水量（ml）蛋白质含量（卩g）020406080 100y = 0.005387X R2 = 0.99220406080蛋白质质量数/卩go o O4 3 2 a a a A值度光吸o ao o a100 120图1蛋白质质量数与吸光度值线性关系图（雷恩，2016）2、样品测定（1）样品提取：氨基酸含量测试结束后，剩余的样品提取液可以作为该实 验的样品提取液，如果没有上述提取液，则按照下面的方法进行提取。取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用 6ml蒸馏水冲洗研钵， 洗涤液收集在同一离心管中，在 4000r/min下离心10min,弃去沉淀，上清液转 入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。（2） 吸取样品提取液，放入具塞试管中（每个样品重复 2次），加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度， 并通过标准曲线查得蛋白质含量。（3）结果计算（单位 mg/g）样品中蛋白质含量=（C VT） /

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