Southern Blotting技术总结

1、Southern Blotting技术总结Southern Blotting溶液的配制：、变性缓冲液 1.5M NaCl 0.5M NaOH 、中和缓冲液 1.5M NaCl 1.0 MTrisHCl Tris,HCl调pH8.0 、20×SSC 1L 3.0 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠 pH7.0)、2×SSC:0.3 M NaCl, 0.03 M 柠檬酸钠(pH7.0)、洗膜液的配制： 2×SSC，0.1%SDS、洗膜液的配制： 0.5×SSC，0.1%SDS、Washing Buffer: 0.1 M Maleic Acid，0.15 M

2、NaCl（pH7.5）,0.3%(V/V) Tween、Maleic Acid Buffer：0.1M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5）、1×Blocking Solution：10×Blocking Solution(vial6),用Maleic Acid Buffer稀释10倍（现配现用）；、Antibody solution:每次使用前，4,10000rpm离心Anti-Digoxigenin-AP (vial 4) 5min，小心从表面吸取所需剂量，用1×Blocking Solution按1:5000 稀释Anti-Digox

3、igenin-AP，2-8可稳定保存12h.、NBT/BCIP 用前37水浴溶解。一、基因组DNA的制备要点：1、DNA纯度要高，最好有除去多聚糖的纯化步骤，如醋酸铵等。2、DNA 完整性好；3、酶切体积要大：反应体积1ml，可分2个0.5ml离心管进行，每个离心管的DNA量至少25g（尽量少留空气，防止蒸发，盐浓度增加）；4、两管的DNA量3040g，最高50g；5、内切酶用量：按照说明加入内切酶，消化期间颠倒混匀，可于反应中间再加1-2l酶量（总体积的1/10），消化时间：12小时左右。最后的1-2小时加RNase酶。二、探针制备（试剂盒）1、标记原理 Dig-dUTP 在Taq DNA

4、聚合酶的作用下，经基因特异的引物PCR 指数扩增，可掺入到新合成的DNA 分子中，从而完成DNA 探针的标记。在延伸反应中，每2025 个核苷可有一个Dig-dUTP 分子掺入到新合成的DNA 链9中。2、操作步骤（1）、PCR扩增 目的基因序列PCR扩增（2）、PCR扩增产物的纯化与回收 胶回收，分光光度计测浓度和OD值纯度（定量）（3）、探针标记（随机引物法）取回收纯化的目的基因扩增产物（待标探针）1g(1l)，加无菌蒸馏水定容至16l。变性：水浴锅中煮沸（100度）10min，快速置冰上5 min；混匀PIG-High Prime（Vial 1），取4l到变性DNA，混匀并稍离心。37&

5、#176;C反应20 h。加2l 0.2 M EDTA(pH 8.0)终止反应（65°C，10min），-20°C保存备用。三、DNA（gDNA）酶切产物回收纯化1、将酶解产物装入2ml离心管中；2、加入1ml酚：氯仿：异戊醇去蛋白，比例25:24:1（可以现买，去最下层）；离心1200rmp，室温，10min，留下上清液。3、加入等体积异丙醇（-20度保存），1/10总体积NaAC（3mol/L）沉淀DNA，12000rmp，室温，20min;（NaAC：在400mL双蒸水溶解123.045g无水乙酸钠，用冰乙酸挑PH5.2或用稀乙酸调PH7，加水定容至500mL，再高压

6、灭菌，待用）4、75%酒精1ml洗管23次，悬浮DNA；5、转到一个新的2mL的离心管中，待吹干酒精后再加50 l ddH2O溶解沉淀。测浓度！四 凝胶处理1、制备100ml 0.85%琼脂糖胶，胶板尾垫2层纸（加样孔增厚，加入80 ml，放8孔梳子）；2、将回收酶切DNA 50l分两份，加6×loading Buffer，每份加5l；3、梳子和电泳槽使用前用0.5-1.0 M NaOH处理30-60min，去EB；4、每个泳道DNA上样30l（至少20g），每份样品分两孔。样多时，一半胶加样，另一半做重复，Marker加中间（最好每半块胶有一个Marker/15000+2000），

7、用于EB染色检测，阳性对照可用质粒（PCR目的片段等），阴性可用转基因受体品种。 5、按1V/cm电压在琼脂糖（TBE电解液）上进行小伏电泳过夜，待溴酚兰跑至胶4/5处（不能过头），切胶，一半胶EB染色检查，拍照，看条带是否跑出边界。另一半用于杂交。将用于杂交的半块胶放入0.25M HCl中置15min，直至蓝色变为浅黄色（目的片段较大时，在用这一步）。无菌/去离子水冲洗3次（洗胶容器“培养皿”预先用1M NaOH 处理30分钟）； 加入变性液浸没凝胶，定温（2225）轻摇15min（双链变单链），再加入变性液，轻摇15min。无菌/去离子水冲洗三次。 加入中和液，定温轻摇20min，更换中和

8、液，摇20分钟，无菌/去离子水冲洗23次； 加入20×SSC室温轻摇1020分钟，预渗透凝胶（20×SSC转移中到小分子量；10×SSC转中至大分子量）。五、制桥与转膜（带无粉手套，用于20×SSC转移槽，预先用1M NaOH浸泡） 剪3层Whatman 3 mm滤纸（长可垂及槽底，宽应比吸光度长0.5cm）; 用20×SSC浸透，用1M NaOH处理过的玻棒滚动赶走气泡； 在滤纸上加足20×SSC，同时从一边慢慢孔朝下沿与滤纸垂直方向放置凝胶，胶与滤纸边各留0.5cm； 剪宽2cm左右Parafilm，手勿接触，干净面盖胶四周，加样

9、孔可全遮盖，其它边不得遮盖样品。 剪与胶大小一样的尼龙膜，去角作标记，沿胶一边向另一边慢慢放尼龙膜（注意，不能有气泡，如有，玻棒赶尽；不能移动）。 将2张与膜大小相同的Whatman 3 mm滤纸置20×SSC中湿润，盖在膜上，排除气泡。 滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸（810cm），吸水纸上放一块大小适宜的玻璃板，上压0.5kg左右重物（此250g），可用瓶装适量水调整，先轻（200g）后重，过夜。吸水纸可更换。六、探针标记效果测定按下表，分别稀释标记DIG的对照DNA标准（vial 2）和DIG标记的探针。首先把标准DNA和标记探针稀释到1ng/ul。管号（1.5ml）DNA（

10、ul）吸取管DNA稀释buffer（vial 3, ul）稀释比终浓度管1母液1ng/ul管22ul管1（母液）1981：10010 pg/ul管315管2351：3.33 pg/ul管45管2451：101 pg/ul管55管3451：100.3 pg/ul管65管4451：100.1 pg/ul管75管5451：100.03 pg/ul管85管6451：100.01 pg/ul管90500将两种稀释液混匀后按顺序在尼龙膜上点样（戴手套）尼龙膜长6cm左右，可在中间用铅笔轻点标记，吸1ul 管2-管9混合液，DNA标准与探针对应点好。稍干后放两张干净滤纸间，120烘干30min，放以干净自封

11、袋中，4可长期保存。将点探针尼龙膜放一尺寸合适的塑料袋中（自封，勿太大），先加20 ml Maleic Acid Buffer，1525轻摇25min；加入10ml Blocking solution（吸1ml vial 6+ 9ml Maleic Acid Buffer）（vial 6要提前溶解）, 室温轻摇30min, 倒掉；加入10 ml（本试验20 ml ）Antibody Solution（用1×blocking Solution，按10ml：2ul vial 4配制），室温轻摇30min, 倒掉；（vial 4用前4 10000rp离心5min，从表面吸）；用10 ml

12、（本试验20 ml）Washing buffer洗膜15min，2次。在10 ml（本次20 ml）Detection buffer平衡2-5min。 暗配置2ml显色液（Color substrate solution，40 ul NBT/BCIP （vial 5）+2ml Detection buffer）（可多配制10-15ml）。（本次15ml，300 ul NBT+15ml Detection buffer）。 倒样中溶液，加入中显色液，赶尽气泡，暗处室温放置，隔30min观察一次，用相机拍照。根据样品与对照同时出现的点，估算标记探针与标准对照的对应浓度，比较效率与对照的百分比。如：

13、标准对照10 pg/ul310.30.10.03标记探针10 pg/ul310.30.20.0同时出现则标记探针是标准对照的1/3。七、膜固定与预杂交 将转DNA膜用镊子（NaOH处理）去除上层滤纸，在膜加样孔处做标记（测距离）；（所用的胶要EB染色，以确定是否转膜成功） 在2×SSC中慢慢放入再拿出，（在边角点阳性对照如质标），小心放入两层滤纸中120烘30min； 预热DIG Easy Hyb granules（vial 7）至42，取15 ml加入放膜自封袋中，42轻摇预杂交50 min。 探针变性：100加热DIG标记探针5min，迅速放冰上。 预热（42）DIG easy

14、Hyb granules（vial 7）, 加20ml于一新自封袋中，用镊子转膜，加入15ul变性DIG标记探针，混匀，赶尽气泡。） 42轻摇温育过夜。八、洗膜（操作过程，转膜要迅速）1、洗膜（样品面向上）A：2×SSC+0.1%SDS室温（15-25）轻摇洗膜5min，2次；B：0.5×SSC+0.1%SDS 65轻摇洗膜15min，洗1次；C：（G+C含量>40%，探针100%配对）0.3×SSC+0.1%SDS轻摇洗膜（68）洗1次15 min；（强洗，降低背景，可再降SSC浓度，但要小心；Antibody是通用的，一是和DIG结合，另一方面带有酶，可发生显色反应）。九、免疫测定（室温）用Washing Buffer (100-200 ml),洗1-5min (膜迅速转入，轻摇)；在100 ml Blocking solution中轻摇，室温保育1小时（可延长至2小时，降低背景）；在100 ml Antibody solution ,轻摇室温保育1小时（可延长，多结合）；用100 ml Washing Buffer轻摇，洗2次各15min；在60 ml Detection Buffer中平衡2-5min；配制60 ml Color substrate solution (1.2ml NBT/BCIP+58.8ml Detection Bu