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弓形虫
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弓形虫的最新检测方法,弓形虫,最新,检测,方法
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. 38 .i n s p e c t i o n a n d q u a r a n t i n e s c i e n c e 检验检疫科学v o l . 1 7 n o . 3 2 0 0 7 年第3 期=2417=834cuku (). mg/kg. mg/kgw对于黄黑条印花棉布，由于随机效应不确定度采用级差法评定，得到的不确定度的自由度降低，不确定度评定的可靠性也有所降低，而且随机效应导致的不确定度值也较大。为了增加评定的可靠度，取扩展因子k = 3 则扩展不确定度为：邻甲苯胺：=3273=819cuku (). mg/kg. mg/kgw6 结果及讨论红色染色棉布检出芳香胺的含量为：4 - 氨基联苯（2 3 . 2 3 . 8 ）m g / k g , 联苯胺( 3 7 3 8 3 ) m g / k g ，k = 2 。黄黑条印花棉布检出邻甲苯胺的含量为（3 8 5 8 2 ）m g /k g , k = 3 。从表2 可看出，在本次实验条件下，u ( w r e p ) 对不确定度总量贡献最大，对3 种检出的芳香胺，由过程随机效应导致的不确定度均占总不确定度的8 5 % 以上，这可能是由于e n 1 4 3 6 2 - 1 : 2 0 0 3 规定的检测过程繁琐（保险粉还原、硅藻土吸附、液液分配、蒸发浓缩，氮吹）造成芳香胺损失较大，也可能是因为芳香胺性质不稳定、容易挥发造成的。因此，e n 1 4 3 6 2 -1 : 2 0 0 3 对大部分芳香胺的回收率仅规定为6 0 % ，有的甚至低至2 0 % 。参考文献 1 倪育才. 适用测量不确定度评定 m . 北京：中国计量出版社， 2 0 0 4 ，第1 版. 2 中华人民共和国计量行业标准. 测量不确定度评定与标示 s . j j f 1 0 3 3 - 2 0 0 1 . 3 曹锡忠. 纺织品中甲醛含量测定的不确定度评估 j . 纺织标 准与质量，2 0 0 3 ，( 1 ) . 4 国际标准化组织标准. 测试和校准实验室能力通用要求 s . i s o / i e c 1 7 0 2 5 ：1 9 9 9 . 5 欧盟标准. 纺织品禁用偶氮染料测定 s . e n 1 4 3 6 2 - 1 : 2 0 0 3 .弓形虫 p c r检测方法的建立刘继红 汪 琳 柏亚铎 蒲 静 王希平（北京出入境检验检疫局，北京，1 0 0 0 2 6 ）摘 要：针对人畜共患的寄生虫弓形虫设计特异引物，建立p c r 快速检测鉴定方法，并用临床样品和其他6 种病原体验证检测方法的特异性、灵敏性等参数，证实了该方法的准确性、可用性。关键词：弓形虫 p c r 检测中图分类号：s 8 5 2 . 7 q 5 0 31 前言弓形虫病是一种由弓形虫（t o x o p l a s m a g o n d i i ）引起的人畜共患病，弓形虫病的传播与流行给畜牧业生产带来很大损失，尤其对养猪业的危害极大。猪弓形虫病是猪发生流产和死胎的原因之一，已证实弓形虫能够通过胎盘、子宫、产道及初乳等途径传播 1 ，死亡率高达3 0 % 4 0 % ，其中以乳猪死亡率最高。本病确诊比较困难，活体组织检查或动物接种阳性者虽可确诊，但成功率低且耗时费力。血清学方法在临床上应用很多 2 ，但目前国内还没有生产出令人满意的试剂盒，且弓形虫可在动物细胞内持久的寄生，因此某些免疫学方法难以区分近期或远期感染 3 。由于类风湿因子等引起的假阳性结果的存在，使免疫学方法的检测存在一定的缺陷。p c r是一种在体外模拟自然d n a 复制过程的核酸扩增技术，具有操作简单、快速、特异和灵敏的特点 4 ，可以弥补以上诊断方法的不足，在弓形虫病的诊断中具有重要的价值。2 材料与方法2 . 1 材料2 . 1 . 1 虫株与病原体弓形虫r h 强毒株由中国农业大学动物医学院赠送；体重 2 0 g 左右的小白鼠购自军科院实验动物中心；微孢子虫、密螺旋体、结核杆菌、传热性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪伪狂犬病毒由北京出入境检验检疫局动检实验室提供。2 . 1 . 2 相关试剂t a q d n a 聚合酶、4 种d n t p 混合物（2 . 5 m m ）、分子量m a r k e r 购于宝生物工程有限公司，其他化学试剂均为分析纯。2 . 2 方法2 . 2 . 1 引物设计与合成 根据b u r g 1 9 8 8 5 年报道的弓形虫s a g i 的序列设计合成1 对引物，扩增长度为2 7 0 b p ，由北京奥科生检验检疫科学 i n s p e c t i o n a n d q u a r a n t i n e s c i e n c e2 0 0 7 年第3 期 v o l . 1 7 n o . 3. 39 . m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 4 0 0 b p 2 0 0 b p图2 p c r 检测特异性实验 m ：2 0 0 0 b p d n a m a r k e r 1 ：阳性对照 2 ：弓形虫模板 3 ：微孢子虫 4 ：密螺旋体 5 ：结核杆菌 6 ：胸膜肺炎放线杆菌 7 ：副猪嗜血杆菌 8 ：猪伪狂犬病毒 9 ：阴性对照物技术有限公司合成，其序列为：p l ： 5 - g t t g a a t t c g g g g a t t c t g c t a g t c t c - 3 p 2 ： 5 - g t g g a a t t c g a c t c c a t c t t t c c c g c a - 3 2 . 2 . 2 p c r 反应体系及程序反应总体积为2 0 l ，其中1 0 b u f f e r 2 l ，4 d n t p 0 . 7 5 l （2 . 5 m m ），引物各0 . 2 l ，模板1 l ，t a q 酶0 . 2 5 l ，上述反应混合物于9 5 变性4 m i n 后进入循环，9 4 3 0 s . ，5 8 3 0 s . ，7 2 3 0 s . ，3 2 个循环后7 2 延伸5 m i n ，4 保存，反应设阴阳性对照。2 . 2 . 3 p c r 产物的鉴定取1 l 扩增产物经1 . 0 % 的琼脂糖凝胶电泳（含0 . 5 m g / m l 溴化乙锭）后，于紫外检测仪观察，有2 7 0 b p 条带者判为阳性。2 . 2 . 4 模板的制备( 1 ) 虫体的收集与消化：将保存于液氮罐中的弓形虫速殖子复苏，0 . 5 m l 接种小鼠腹腔，3 4 d 后处死，用无菌生理盐水洗腹腔，收集腹腔液，经过计数板计数后，虫体的浓度为6 . 8 1 06个/ m l 。取1 0 0l 腹腔液( 临床诊断时取1 0 0 l 动物抗凝血) ，离心弃上清，沉淀悬浮于裂解液中5 5 2 h 。虫体复苏及检查：预先将水浴恒温箱调到3 7 3 8 后，从液氮罐内取出盛有虫体的管子，放入水浴箱内，轻轻摇动使虫体快速解冻，然后用 p h 7 . 2 的p b s 或h a n k s 液洗去保护剂。取少量虫液用澳酚蓝染色，再滴入白细胞计数器的板上检查活虫数目，不着色者为死虫，染成蓝色的为活虫。( 2 ) 模板的提纯：将虫体用消化液（裂解b u f f e r ：0 . 1 m t r i s - h c l （p h 8 . 0 ）， 1 % s d s ，0 . 1 m n a c l ，1 0 me d t a ）在放于5 5 水浴锅内裂解2 h ，离心（1 0 0 0 0 r /m i n , 5 m i m ）吸上清，等体积苯酚：氛仿：异戊醇（2 5 ：2 4 ：1 ）混匀，离心（5 0 0 0 g 1 0 m i n ），再抽提一次，吸上清，加2 倍体积无水乙醇，0 . 1 倍体积3 m n a a c 于- 2 0 沉淀3 0 m i n ，1 0 0 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n ，沉淀用7 0 % 乙醇洗一次，自然干，用2 0 l d d h20 溶解，- 2 0 保存。2 . 2 . 5 p c r 检测方法的优化用不同浓度的m g c l2分别进行p c r 检测，确定最适的反应浓度。用不同的退火温度分别进行p c r 反应，以确定最佳的退火温度。2 . 2 . 6 p c r 检测方法的敏感性测定将提纯的弓形虫模板倍比稀释，分别稀释成每1l 模板所对应的虫体个数为：3 . 4 1 04个，3 . 4 1 03个，3 . 4 1 02个，3 . 4 1 0 个，3 . 4 个，1 . 7 个，0 . 8 5 个。然后同样条件下进行p c r 检测。2 . 2 . 7 p c r 检测方法的特异性测定分别用微孢子虫、密螺旋体、结核杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪伪狂犬病毒d n a 做为对照，无菌去离子水作为空白对照，同样条件下进行p c r 反应。3 结果与讨论3 . 1 弓形虫速殖子在小白鼠的腹腔内接种后，注意观察发病情况，如有皮毛松竖、不活泼、弓背、闭目、腹部膨大、颤动或呼吸急迫等病状，即应解剖，取腹水作组织涂片，用g i e m s a 染色观察游离的滋养体和包囊。3 . 2 p c r 扩增结果将含有虫体的小白鼠腹水用来提取模板，进行p c r 扩增反应，产物进行0 . 8 琼脂糖凝胶电泳。结果表明可扩增出一条大小为2 7 0 b p 的特异核酸带（图1 ）。3 . 3 p c r 检测特异性实验分别用微孢子虫、密螺旋体、结核杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪伪狂犬病毒阳性病料提取d n a ，做为对照，无菌去离子水作为空白对照，弓形虫阳性模板作为阳性对照，同样条件下进行p c r 反应，经琼脂糖凝胶电泳，均未见有特异性条带（图2 ），说明引物特异性高，适合于弓形虫s a g i 的特异性扩增。图1 s a g i 扩增结果m ：m a r k e r ; 1 ：阳性对照 2 ：弓形虫模板 3 ：阴性对照 m 1 2 3 4 0 0 b p 2 0 0 b p. 40 .i n s p e c t i o n a n d q u a r a n t i n e s c i e n c e 检验检疫科学v o l . 1 7 n o . 3 2 0 0 7 年第3 期图3 p c r 检测灵敏度试验m . 2 0 0 0 b p d n a m a r k e r 1 . 阳性对照2 . 3 . 4 1 04个虫体的模板 3 . 3 . 4 1 03个虫体的模板4 . 3 . 4 1 02个虫体的模板 5 . 3 . 4 1 0 个虫体的模板6 . 3 . 4 个虫体的模板 7 . 1 . 7 个虫体的模板8 . 0 . 8 5 个虫体的模板 9 . 阴性对照3 . 4 p c r 检测灵敏度试验将提纯的弓形虫模板倍比稀释，然后进行p c r 扩增，所得产物经琼脂糖凝胶电泳，发现稀释到0 . 8 5 个虫体时仍可见特异性条带（图3 ）。3 . 5 临床样品检测对北京1 1 个猪场的8 5 份血样进行p c r 检测，在1 1个猪场中有阳性猪场为9个，平均检出阳性率为4 0 % 。临床采集8 份可疑病例的抗凝血和血清，分别用来做弓形虫s a g i 的p c r 检测和间接血凝检测，同一个样品的p c r 扩增结果为阳性，其对应的间接血凝结果也为阳性，表明这两种方法的结果相吻合。本实验也用鸡、猫、狗的抗凝血提取d n a 作为模板，进行p c r 扩增，均证实了本方法的可行性。s a g i 是弓形虫速殖子膜表面的主要抗原 6 , b u r g于1 9 8 8 年报道了编码s a g i 基因序列，根据己发表的基因序列设计合成一对特异性引物，用于弓形虫d n a扩增。目前，由于免疫学方法本身的一些不足 7 ，分子生物学手段已应用于弓形虫病的检测，而p c r 技术可检测临床标本中更少的病原体，甚至可以将有血清学交叉反应的h a m m o n d i a h a m m o r d i i 属与弓形虫区分开来，这在弓形虫病的诊断中具有重要价值。h o h l f e d 等扩增的b 1 基因检测先天性弓形虫病的产前诊断，结果表明p c r 的敏感度为9 7 . 4 % 。而常规的检测方法为8 9 . 5 % ，并且操作简便，所需时间短。由于弓形虫可寄生在哺乳类（包括人）、鸟类、鱼类、爬行类的除了红细胞外的任何有核的细胞组织中，说明其选择性不强。因此，在对其进行检测时，标本的取材范围很广，这一点也较适合于分子生物学手段。根据病变部位，可以用心脏血、脑脊液、组织液、淋巴结、腹水、骨髓以及某些组织切片（如眼石蜡切片）等。本文根据弓形虫主要表面抗原s a g i 基因序列设计一对引物，用于弓形虫d n a 扩增。将弓形虫d n a 稀释到一个虫体的量结果还是阳性，表明其具有很高的灵敏度。用微孢子虫、密螺旋体、结核杆菌、传热性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪伪狂犬病毒d n a 做为对照，无菌去离子水作为空白对照，同样条件下进行p c r 反应，其结果均为阴性，表明具有很高的特异性。经过p c r 反应，最终扩增片段为2 7 0 b p ，适于在琼脂糖凝胶电泳上区分。因而此技术具有很好的应用价值。参考文献 1 s z e n a s i z ，o z s v a r z ，n a g y e ，e t a l . p r e v e n t i o n o f c o n g e n i t a l t o x o p l a s m o s i s i n s z e g e d ，h u n g a r y . i n t j e p i d e m i o l , 1 9 9 7 , 2 6 （2 ）：4 2 8 3 5 . 2 p m i n e o t w , d a o s l c a , g h n c o s t a , e t a l . d e t e c t i o n o f i g g a n t i b o d i e s t o n e o s p o r a c a n i n u r n a n d t o x o p l a s m a g o n d i i i n d o g s e x a m i n d e i n a v e t e r i n a r y h o s p i t a l f r o m b r a z i l . v e t e r i n a r y p a r a s i t o l o g y 9 8 , 2 0 0 1 , 2 3 9 2 4 5 . 3 f u x b , r o d r i g u e s c v , p o r t e l a r w , e t a l . r o l e o f c y t o k i n e s a n d m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x r e s t r i c t i o n i n m o u s e r e s i s t a n c e t o i n f e c t i o n w i t h a n a t u r a l r e c o m b i n a n t s t r a i n （t y p e i - i i i ）o f t o x o p l a s m a g o n d i i . i n f e c t i m m u n , 2 0 0 3 ；7 1 ( 1 1 ) ：6 3 9 2 4 0 1 . 4 单连玉，杨秀珍，刘佩梅. p c r 技术检测r h 株弓形虫组织内 感染的实验研究. 天津医科大学学报，2 0 0 2 ，8 ( 4 ) ：4 1 6 4 1 9 . 5 j a w r e n c e b u r g ，d a l i a
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