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弓形虫
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弓形虫的最新检测方法,弓形虫,最新,检测,方法
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弓形虫pcr检测方法的建立及初步应用王胜昌,谢建云,邵伟娟,高诚上海市实验动物质量监督检验站(200032)摘要:根据弓形虫p30基因序列设计二对引物分别进行了pcr一次扩增和套式扩增,结果这两对引物在一次扩增和套式扩增中分别出现预期的扩增片段914bp、522bp和522bp;套式扩增出现的条带比一次扩增出现的条带亮度明显增强。提示套式扩增比一次扩增具有更高的敏感性。用外引物进行扩增后,最低可以检测到1pg的弓形虫dna。 说明所建立的反应体系具有高度的敏感性。 用内引物对人工感染弓形虫的icr小鼠血液、 组织进行弓形虫dna的检测,结果均扩增出522bp的扩增带。根据b1基因序列设计的引物进行pcr一次扩增和半套式扩增。结果均出现预期的扩增片段619bp、362bp和362bp;用半套式扩增检测感染弓形虫的icr小鼠血液、 组织时可扩增出522bp的扩增带,半套式扩增比一次扩增更敏感。关键词:弓形虫;一次pcr;套式pcr;半套式pcr; icr小鼠中图分类号:q 95233文献标识码:a文章编号: 100428448(2003)0120015204收稿日期: 2002206206基金项目:上海市科技发展基金资助项目(004919071)。作者简介:王胜昌(1963- ),副研究员,主要从事实验动物病原体的检测和研究。弓形虫病分布广泛,是一种人兽共患的传染病。实验室常规检测主要是用各种血清学方法。丛斌等认为血清学方法检测适应慢性弓形虫病的诊断1;louism. w eiss等认为血清学方法可以诊断先天性和急性弓形虫病,但由于大多数免疫缺陷的人或动物其抗弓形虫的igg滴度不会上升或不会出现高的igm抗体滴度,所以不能有效的用血清学方法对患有免疫缺陷的人或动物诊断弓形虫病,另外对免疫缺陷的人或动物用抗弓形虫特异性抗体反应的w estern blot也不能有效诊断其弓形虫病2。在弓形虫病诊断过程中直接分离弓形虫抗原需要几天甚至几周时间3,费时费力,在实际应用上意义不大。而pcr技术可以克服上述弓形虫检测方法的不足,可通过扩增检测弓形虫的特异性核酸,直接确认病原体的存在,具有快速、 敏感、 特异的特点,并可了解弓形虫的感染途径,故本文拟建立检测弓形虫的pcr方法,并用所建立的方法对感染弓形虫的icr小鼠进行了检测,现将结果报告如下:1材料和方法1. 1弓形虫来源弓形虫rh株从上海市疾病控制中心引进,本站实验室保存。1. 2对照原虫来源兰氏贾第虫由本站实验室培养、 保存。1. 3试剂所用buffer、dn tp、taq酶等试剂均购自takara公司。1. 4icr小鼠来源及弓形虫的感染清洁级icr小鼠20只,雌雄各半,体重2022g,购自上海西普-必凯实验动物有限公司。对icr小鼠分别进行腹腔接种0. 20. 3 m l的含弓形虫的小鼠腹水。接种56 d后,眼眶采血,颈椎脱臼处死后,腹面朝上,消毒后在腹腔上剪一小口,用灭菌的吸管吸取23 m l灭菌生理盐水注入腹腔,抽洗几次,然后吸出含生理盐水的小鼠腹水,置于灭菌的离心管内, 4保存备用。同时分别取出各小鼠的脑、肝、 脾、 肺、 肾等组织, - 20保存备用。1. 5dna的提取按照dn easytm t issue kit操作手册提取弓形虫、 兰氏贾第虫及感染弓形虫的icr小鼠的血液、 脑、 肝、 脾、 肺、 肾的dna。 试剂盒购自基因公司。测定弓形虫及对照兰氏贾第虫的dna浓度,然后稀释至10 ng?(l, - 20保存。每次扩增均设蓝氏贾第虫、 灭菌超纯水作为对照。1. 6引物51m ar. 2003, 23(1)上海实验动物科学shanghail aboratory a ni mal science根据文献3, 4设计引物,引物长度均为20 bp。1. 6. 1p30基因区引物编号为:p301: 52ttg ccg cgc cca cac tga tg23p302: 52cgc gac aca a gc tgc ga t a g23p303: 52cga ca g ccg cgg tca ttc tc23p304: 52gca acc a gt ca g cgt cgt cc231. 6. 2b1基因区引物编号为:p1: 52ga g a gg tcc gcc ccc aca a g23p2: 52ctg ctg gtg cga cgg ga g tg23p3: 52ca g ga g ttg ga t ttt gta ga23引物由takara(大连)生物工程有限公司合成,其中引物p301p302 (外引物)预期扩增片段为914bp, p303p304(内引物)预期扩增片段为522 bp,套式扩增时预期扩增片段为522 bp;引物p1p2扩增预期片段为619 bp, p2p3扩增预期片段为362 bp,引物p1p2p3采用一管半套式pcr扩增时预期片段为362 bp。1. 7pcr反应体系及扩增程序1. 7. 1p30基因区引物1. 7. 1. 1反应体系:其50l反应体系中加入:10pcr buffer5l(终 浓 度 为1lpcrbuffer)2. 5 mmol?l dn tp4l(终浓度为200mol?l)p301p302各1l(终浓度为0. 2mol?l)(或p303p304)taq酶0. 2l(1u)dna模板10l灭菌超纯水28. 8l1. 7. 1. 2扩增程序941 m in955 m in601 m in30次循环7410 m in743 m in1. 7. 1. 3p303p304套式pcr吸取p301p302第1次pcr扩增产物1 ul,用p303p304引物取代p301p302,然后按如下的扩增程序进行扩增。941 m in601m in25次循环7410 m in743 m in1. 7. 2b1基因区引物1. 7. 2. 1一次pcr扩增反应体系:其50l反应体系中加入:10pcr buffer5l(终 浓 度 为1lpcrbuffer)2. 5 mmol?l dn tp4l(终浓度为200mol?l)p1p2(或p2p3)各1l(终浓度为0. 2mol?l)taq酶0. 2l(1u)dna模板10l灭菌超纯水28. 8l1. 7. 2. 2一管半套式pcr扩增反应体系:其50l反应体系中加入:10pcr buffer5l(终 浓 度 为1lpcrbuffer)da tp0. 4l(终浓度为200mol?l)dctp0. 4l(终浓度为200mol?l)dgtp0. 4l(终浓度为200mol?l)du tp1l(终浓度为400mol?l)p11l(终浓度为0. 01mol?l)p21l(终浓度为0. 1mol?l)p31l(终浓度为1mol?l)taq酶0. 2l(1u)udg0. 5l(0. 5u)dna模板10l灭菌超纯水29. 1l1. 7. 2. 3扩增程序9430s953 m in6030 s 30次循环7210 m in721 m in9430 s5530 s 30次循环7210 m in721 m in1. 8扩增产物分析1. 0%琼脂糖凝胶电泳, tanon uv22000紫外分析仪拍照, gis软件分析。2结果2. 1弓形虫速殖子采集于icr小鼠(接种5日)腹水的rh株弓形虫速殖子(giem sa染色)第34页见图1。2. 2p30基因区引物2. 2. 1两对引物p301p302和p303p304一次扩增结果由图2、3(第34页)可见:引物p301p302和p303p304对弓形虫dna经扩增后分别出现914bp和522bp的扩增带,而作为验证特异性或对照的蓝氏贾第虫、 灭菌超纯水则均无扩增带。2. 2. 2套式扩增结果由图4 (第34页)可见:引物p303p304对弓形虫dna经套式扩增后出现522bp扩增带,而作为验证特异性或对照的蓝氏贾第虫、 灭菌超纯水则均无扩增带。 套式扩增比一次扩增更敏感,经套式扩增后条带亮度明显增强。2. 2. 3敏感性试验由图5 (第34页)可见:用p301p302对已进行10倍梯度稀释后的弓形虫dna进行扩增后,最低可检测到1pg的弓形虫dna。2. 2. 4p30基因区引物检测应用由图6 (第34页)可见:对感染弓形虫小鼠的血液、 组织应用p30基因区引物p303p304能扩增出522bp的扩增带。61上海实验动物科学shanghail aboratory a ni mal sciencem ar. 2003, 23(1)2. 3b1基因区引物2. 3. 1两对引物p1p2和p2p3一次扩增由图7、8 (第34页)可见:引物p1p2和p2p3对弓形虫dna经扩增后分别出现619bp和362bp的扩增带,而作为验证特异性或对照的兰氏贾第虫、 灭菌超纯水则均无扩增带。2. 3. 2b1基因区引物检测应用由图9、10(第34页)可见:引物p1p2对感染弓形虫小鼠的血液、 组织进行dna扩增,结果:在肝、 脾、 肺中扩增出619bp的扩增带。 而血液、 脑。 肾中未见扩增带;用引物p2p3进行扩增,结果:在脑、 肝、 脾、 肺中扩增出362bp的扩增带。而血液、 肾中未见扩增带;两者扩增过程中所设的空白对照均未出现扩增带。2. 3. 3引物p1p2p3一管半套式pcr扩增检测应用由图11 (第34页)可见:对感染弓形虫小鼠的血液、 组织能扩增出362bp的扩增带。3讨论弓形虫p30基因抗原是该虫速殖子表面抗原的主要成分。 在已知众多的弓形虫抗原中, p30具有高度的免疫源性及免疫保护性5;在虫体入侵和虫株毒力等方面发挥重要作用6。根据弓形虫p30基因设计的两对引物p301p302和p303p304分别进行了pcr一次扩增和套式扩增。结果显示:这两对引物在一次扩增中分别出现预期的扩增片段914bp和522bp;进行套式扩增时也出现预期的扩增片段522bp。套式扩增出现的条带比一次扩增出现的条带亮度明显增强。预示套式扩增比一次扩增具有更高的敏感性。弓形虫dna经梯度稀释后用引物p301p302扩增,最低可以检测到1pg的弓形虫dna。说明所建立的反应体系具有高度的敏感性。选用p303p304引物对感染弓形虫的icr小鼠血液、 组织进行弓形虫dna的检测,结果均扩增出522bp的扩增带。在应用这两对引物进行扩增过程中,作为对照的蓝氏贾第虫和灭菌超纯水均未出现扩增带,说明所设计的这两对引物具有特异性。弓形虫b1基因具有种的特异性。根据弓形虫b1基因设计的引物p1p2p3分别进行了一次扩增和一管半套式扩增。 结果显示:在一次扩增中分别出现预期的扩增片段619bp和362bp,而作为对照的蓝氏贾第虫和灭菌超纯水均未出现扩增带,说明所设计的这两对引物具有特异性。在对感染弓形虫的icr小鼠的血液、 组织进行pcr扩增检测时,引物p1p2在肝、 脾、 肺中扩增出619bp的扩增带,而血液、 脑、 肾中未见扩增带;引物p2p3在脑、 肝、 脾、肺中扩增出362bp的扩增带,而血液、 肾中未见扩增带;两者扩增过程中所设的空白对照均未出现扩增带。引物p1p2p3一管半套式扩增能检测到感染弓形虫的icr小鼠血液、 组织中的弓形虫dna。提示:在检测感染弓形虫的小鼠血液、 组织中的弓形虫dna时,b1基因区引物一管半套式扩增比一次扩增更敏感。pcr检测方法不但可以弥补血清学方法不能检测免疫缺陷的人或动物的弓形虫病,而且pcr检测方法是一种更为快速、 敏感的检测方法。套式pcr比一次pcr更敏感,但套式pcr所用时间比一次pcr长,而且套式pcr时需要两只扩增管,这样容易造成样本之间的交叉污染。本文根据弓形虫b1基因设计的引物进行半套式pcr,由于在同一扩增管中进行扩增,而且反应体系中udg可消除其它阳性样本pcr产物可能带来的污染,故既增加了敏感性又克服了套式pcr易污染的不足。参考文献:1丛斌,姚玉霞,尤红煜,等.聚合酶链反应检测实验动物弓形虫核酸的研究j .中国实验动物学报, 1998, 6(2): 9- 12.2 louism. w eiss, stephen a. u dem , m iklos salgo,etal.sensitive and specific detection of toxoplasmadna in an experi mentalm urinem odel: u se of toxo2plasma gondii2specific cdna and the polymerase chainreaction j .the journal of infection d isease 1991,163: 180- 1863 pujol2rique m , derouin f, garcia2u intanilla a ,et al.design of a one2tube hem i2nested pcr for detection oftoxoplasma gondii and comparison of three dna pu2rification methodsj . j. m ed. m icrobiol, 1999, 48: 857- 862.4林万明. pcr技术操作和应用指南m .北京:人民军医出版社, 1993. 282- 284.5杨秋林,陆惠民,闵太善,等.弓形虫昆山分离株p30抗原基因的克隆与表达,中国人兽共患病杂志, 2001, 17(4): 27- 296沈继龙,徐秉锟,等.弓形虫抗原研究进展j .中国人兽共患病杂志, 1990, 6(3): 50.(下转第20页)71m ar. 2003, 23(1)上海实验动物科学shanghail aboratory a ni mal scienceof paclitaxel in balloon2injured rat carotid arteriesj . jv asc interv radiol, 2001, 12(1): 79- 88.7 rsschwartz,jg m urphy,wdedwards,etal.restenosis after balloon angioplasty. a practical prolif2erative model in porcine coronary arteriesj . circula2tion, 1990, 82: 2190- 2200.8 ferns ga , a vades ty. the mechanism s of coronaryrestenosis: insights from experi mentalmodelsj . int jexp pathol, 2000 , 81(2): 63- 88.experi mental study on vascular restenosis afterstent i mplantation in can ine femoral arteryguo jun, yan g shu2ting(general h osp ital of pla,b eijing100853,china)abstract: to establish the model of restenosis,the metal stent was implanted into the caninefemoral artery through the carotid artery.twelve weeks after the stent implanted, the lumen ofcanine femoral artery was reduced significantly as a result of smooth muscle cell proliferation andneointima formation. thismodel is reliable, easier to operate, and resembling the same pathologi2cal changes of clinical restenosis.it is an idealmodel for restenosis research.key words: restenosis; stent; femoral artery(上接第17页)establishment and preli m inary application of polymerasechain reaction fortoxop lasma gondiiwan g sheng2chang, x ie jian2yun, shao w ei2juan, gao cheng(s hanghai q uality m onitoring center for l aboratory a nim als,s hanghai200032,china)abstract: two kinds of specific and sensitivemethods for detectingt ox op lasm a gond iiwas estab2lished by means of n t2pcr and one2tube hem i2n ested pcr.the dna s were extracted fromt ox op lasm a gond ii、giard ia lam bliaand also blood、brain、liver、spleen、lung、kidney tissue of icrm ice infected w ith toxoplasma gondii by routine methods.two dna fragments of the expectedsize(522 bp and 362 bp)was ampliflied from toxoplasma gondii、blood、brain、liver、spleen、lungand kidney tissue by using n t2pcr and hem i2n ested pcr rspectivelly, but no band was ob2served in giardia lamblia. the sensitivity of the reaction was determ ined w ith different
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