资源目录
压缩包内文档预览：
编号：177864893
类型：共享资源
大小：1.66MB
格式：RAR
上传时间：2021-12-23
上传人：扣***
认证信息
机构认证
宁夏凯米世纪网络科技有限公司
宁夏
统一社会信用代码/组织机构代码
91640100MA774ECW4K
IP属地：宁夏
12
积分
- 关 键 词：
-
弓形虫
最新
检测
方法
- 资源描述：
-
弓形虫的最新检测方法,弓形虫,最新,检测,方法
- 内容简介：
-
条带,出现了干扰现象。 通过二条条带的相对和绝对距离可以鉴别出8个不同的近交系小鼠,表明二重pcr可应用于近交系小鼠的遗传检测,二重pcr遗传检测方法具有方便简单、 省时的优点。关键词:多重pcr;近交系小鼠;遗传检测a110两种pcr检测弓形虫方法的建立及研究陈俏梅,张俐(上海生物制品研究所,上海200052)建立用于实验动物弓形虫感染检测的敏感、 稳定、特异的pcr检测体系,用b1基因设计引物,建立普通pcr,用p30基因设计引物,建立巢式pcr;用两种方法检测实验感染弓型虫小鼠血液和腹腔中的dna动态变化;用巢式pcr检测自然状态下的豚鼠感染率。结果,巢式pcr可检测到0. 01pgdna含量,比普通pcr敏感100倍,且特异性强,对其他微生物dna无交叉现象,稳定性好,对同一样品重复检测三次,阴、 阳性结果一致。 小鼠感染弓形虫2 d后,巢式pcr腹水阳性率为100% ,血液阳性率为33. 3%;感染阳性率为66.7%;感染4d后,血液阳性率为83. 3%;正常豚鼠血测定,结果为阴性(0?25)。 结果提示巢式pcr方法可用于早期实验动物弓形虫感染的检测,具有敏感性高、 特异性强、 稳定性好的特点。关键词:弓形虫;普通pcr;巢式pcr;实验感染a111实验动物弓形虫spa-el isa检测方法的初步建立屈霞琴,姜文琴,王健(上海生物制品研究所国家实验动物寄生虫检测中心,上海200052)报道了实验动物弓形虫抗体spa2el isa检测试剂的研制,结查表明:作者研制的spa2el isa检测试剂以葡萄球菌a蛋白为酶标记第二抗体,可用于大多数哺乳类动物的检测;与ifa检测试剂比较,符合率100%;与iha比较,检出率高于iha;与国内同类试剂比较,符合率为95. 65% (44?46)。关键词:实验动物;弓形虫; spa2el isaa112庚型肝炎病毒转基因小鼠的特性研究胡卫江,戚中田,李建秀,胡以平(第二军医大学,上海200433)庚型肝炎病毒(hgv)是一种新发现的与肝炎相关的病毒,作者已克隆了hgv的全长基因,并制备了含有庚型肝炎病毒(hgv)全长基因的转因基小鼠。 作者以本室构建的hgv转基因小鼠为材料,取转基因小鼠的各种组织进行rt2pcr、 免疫组织化学、w esternblotting等实验,分析hgv基因在转基因小鼠体内的复制、 表达及前体蛋白的剪切。 并以外周血单核细胞(pbmc)及血清rna阳性的转基因小鼠血清接种molt24细胞,鉴定细胞及上清中的hgv rna以及hgv病毒颗粒,研究hgv的传染性。 结果发现hgv的正、 负链rna以及蛋白产物可以在多个组织内检测到,即hgv具有泛嗜性。hgv rna在molt24细胞内及上清中间歇性阳性及细胞上清的w estern2blotting阳性结果证明了hgv转基因小鼠具有传染性。关键词:庚型肝炎病毒;转基因小鼠;复制;表达;传染性a113乙醇对小鼠胚胎体外发育影响的研究崔淑芳,郝光荣,孙伟,曹平(第二军医大学实验动物中心,上海200433)用含不同浓度乙醇的w hitten氏培养液对小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎分别进行体外培养,研究乙醇对小鼠不同发育时期胚胎体外发育的影响。首先利用含0. 01%、0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%、3.0%、5. 0%、10. 0%乙醇的w hitten氏培养液对2细胞胚胎进行培养,观察研究小鼠2细胞胚胎对培养液中乙醇浓度的耐受极限。 然后再用含1%和3%乙醇的w hit2ten氏培养液分别对小鼠2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎进行培养。 结果:含低浓度乙醇(1%以下)的培养液对外细胞胚胎和桑椹胚的囊胚形成有促进作用,而在2细胞和4细胞胚胎中则影响不明显。 含高浓度乙醇(3% )的培养液则对各期胚胎有不同程度的抑制作用,但随着胚胎发育其对乙醇的耐受力将逐渐增强。关键词:乙醇;小鼠,胚胎;体外发育a114建立减压病模型的动物选择翼仲义,袁锦富,胡开元,王庆蓉,雷呈祥,王艳军(海军医学研究所,上海200433)选择能找到减压致病靶器官的动物,将有利于寻找减压病(doc)病因。 使兔、 豚鼠、 犬经高气压环境,暴露不充分减压后,间断固定兔、 豚鼠显微球结膜,用3%戊巴比妥钠静脉醉犬,手术暴露股动脉测血压,清醒后观察行为。 结果显示,球结膜血管痉挛、 功能障碍的兔、豚鼠都有dcs症状,dcs的严重性与血管痉挛、 功能障碍的程度呈正相关。 豚鼠球结膜动脉易被气泡充填,气泡在血流作用下极易变形、 分流,随血液循环减压后515 m in内,血压逐渐上升到20020 mmhg的犬,清醒后都患脊髓dcs。 豚鼠在清醒状态能找到减压致病的靶器官,犬血管痉挛,血压升高是严重dcs的可靠指标。091 1994-2010 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 动物模型的研究 1 中国糖尿病杂志 1995;3(2) :1054papaccio g,frascatore s, esposito v ,et al. early macrophageinfiltration in mice treated with low - dose streptozotocin de2creases islet superoxide dismutase levels: prevention by silicapretreatment.acta anat1991;142(2) :1415takasa n ,k omiya i,asawa t,et al. streptozotocin - and alloxan- induced h202 generation and dnafragmentation in pancreat2ic islets.diabetes1991;40(9) :11416 李 强 1iddm胰岛细胞损伤机制的研究进展 1 国外医学临床生物化学与检验学分册 1999;20(3) :1307 郑里祥 1stz和alloxan联合使用复制实验性糖尿病大鼠模型 1 中国病理生理杂志 1999;15(8) :7588 刘学政,郭凤芸,萧 鸿,等 1 实验性糖尿病大鼠视网膜毛细血管变化规律i1 血管铺片形态学观察 1 锦州医学院学报 1999;20(1) :89 刘 健,王克模,曹东元,等 1 大鼠糖尿病痛过敏模型的建立 1 西安医科大学学报 1996;17(2) :13610 贾雪梅,齐易祥,王惠珠,等 1 实验性糖尿病对小鼠肝脏酶组织化学和超微结构的影响 1 解剖学杂志 1995;18(5) :45111lynch jj 3rd ,jarvis mf,k owaluk ea ,et al. an adenosine ki2nase inhibitor attenuates tactile allodynia in a rat model of dia2betic neuropathic pain. eur j pharmacol1999;364 (2 - 3) :14112 李 晶,张春元,张宝珍,等 1 四氧嘧啶诱发大白兔糖尿病模型的研究 1 中国校医 1999;13(1) :3013 杨竹林,伍汉文,周智广,等1 完全弗氏佐剂预防nod鼠胰岛炎和糖尿病的机理研究 1 中华内分泌代谢杂志 1999;15(5) :27114 杨秀伟,王多佳 1 四氧嘧啶与自由基反应 1 国外医学内分泌分册 1994;14(3) :14415 孙子林,葛祖恺 1 糖尿病动物模型及其进展 1 中国糖尿病杂志 1999;7(4) :22716andre l , g onzalez a ,wang b ,et al. checkpoints in the pro2gression of autoimmune disease;lessons from diabetes models.proc natl acad sci usa1996;93:226017moller de. perspective in diabetes transgenic approaches to thepathogenesis of niddm.diabetes1994;43:139418dali d ,svetlanov a ,lee hw,et al. animal model for maturityonset diabetes of the young generated by disruption of themouse glucokinase gene.j biol chem1995;270:21464中国弓形虫病流行病学研究近况广西壮族自治区卫生防疫站(530021) 吕元聪 弓形虫病(t oxoplasmosis)是由刚地弓形虫(t oxo2plasma gondii)引起的一种人兽共患寄生虫病,呈全球性分布。人感染弓形虫后,绝大多数为隐性感染,一旦发病则导致各种先天和后天性疾病。我国弓形虫的发现,在亚洲是较早的1。1954年于恩庶首先在福建从兔和猫体内分离出弓形虫,1964年谢天华首次在江西报告人弓形虫病例,1977年上海吴硕显首次从 “无名高热” 猪体内分离出弓形虫。1978年崔君兆首次在国内进行流行病学研究。在广西弓形虫病研究的基础上,1983年由广西卫生防疫站牵头组织的中国人畜弓形虫病调查研究协作组(简称本协作组)采用统一iha对19个省的部分地区81968人进行调查,阳性4237人,平均阳性率512 %;调查14个省的部分地区的23种39038头动物,发现阳性动物17种5995头,平均阳性率为1514 %23。所调查的地区均发现有弓形虫感染,它不但造成人兽疾病和死亡,而且可使胎儿致畸,影响人口素质。因此弓形虫病已成为一个严重的、 世界性的公共卫生问题,已引起医学和兽医学界的重视。1 传染源弓形虫病的传染源主要是动物,而人主要是经胎盘的垂直传播才具有传染源的意义。弓形虫在动物中,分布相当广泛。目前已知通过血清学检查证实有抗体的动物有190种1。根据病原学调查,证实有弓形虫的哺乳动物有141种2,但对人来说,畜禽是弓形虫病的重要传染源,尤其是感染弓形虫的猫及猫科动物,在传播本病上具有重要意义。111 猫及猫科动物:猫科动物是弓形虫的终末宿主,在其体内可形成有性繁殖和卵囊(oocysts) ,1只猫1天可排出1000万个卵囊,可持续排2周多时间,当猫再次感染时可重新排出卵囊,所以猫(特别是家猫)是人类弓形虫病的重要传染源。丁贞英等4检查67份猫粪,弓形虫卵囊检出率为4313 % ,等孢球虫卵囊为2814 % ,认为加强猫的管理和猫粪处理,是预防人兽弓形虫病的重要措施。112 家畜:弓形虫在经济疫源地的许多家畜中广泛存在,是弓形虫病的主要传染源。84guangxi medical journal ,jan.2002 ,vol.24 ,no.1 1994-2010 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 11211 猪:猪是弓形虫病的重要传染源。于恩庶等最早于1959年在猪体内发现弓形虫,但当时并未引起重视,直到1977年上海郊区从暴发之 “无名高热”病猪体内分离出弓形虫后,才引起了人们的注意。此后,江苏、 北京、 辽宁、 湖北、 山东、 黑龙江、 浙江和广西等地也先后报告。本协作组1调查各地猪的感染率是:北京1118 %(524头)、 天津2611 %(241头)、广东1116 %(476头)、 广西3014 %(4703头)、 湖南2617 %(738头)、 云南3218 %(235头)、 四川2019 %(225头)、 上海6114 %(1226头)、 江苏3911 %(1790头)、 浙江3011 %(1790头)、 福建1013 %(1533头)。另外,从猪体内分离出20株病原体,其中广东11株、 广西5株、 福建2株、 浙江1株和云南1株。进一步调查表明:从病猪体内分离虫株的阳性率为1119 %(118头) ,比正常屠宰猪分离阳性率111 %(570头)高1018倍,提示病猪肉含有弓形虫的危险性比正常猪肉高10多倍。在猪群中弓形虫的感染不但危害畜牧业的发展,而且是人类的重要传染源,因此对肉品进行检查,防止含弓形虫的肉上市,制定卫生标准,不吃生的或未煮熟的猪肉,做好食品卫生及个人卫生,是预防本病的一项重要措施。11212 其他畜禽:吕元聪、 崔君兆等5在我国的14个省的部分地区用统一的iha调查畜禽的感染率是:牛815 %(5121头)、 羊812 %(2006头)、 鹿818 %(214头)、 狗714 %(1619头)、 牧犬515 %(458头)、鸡1517 %(1568只)、 鸭318 %(2398只)、 鹅1615 %(520只)、 鼠415 %(2852只)、 兔411 %(2655只) ,此外,从兔体内分离出弓形虫9株和鼠类5株。由此可见,家畜和家禽弓形虫感染较为普遍,且较严重,它不仅是人类的传染源,而且因流产或死亡给农村畜牧业造成重大经济损失,严重影响畜牧业发展,应加强研究。综上所述,人类弓形虫病的动物传染源相当广泛,动物的种类多,范围广。不过大多数动物均为隐性感染,其感染率虽高,但临床表现显性症状者却为数不多,这些动物的体表健康却携带病原体,在传播本病上意义重大。2 传播途径弓形虫病的传播方式,已进行了大量研究,积累了不少资料。有的传播方式较明确,如先天性弓形虫病;而获得性弓形虫病的传播方式较复杂,有待进一步研究。211 先天性弓形虫病:先天性弓形虫病系孕妇妊娠期间受到弓形虫感染,虫体通过胎盘在宫内感染胎儿。本病不但会影响胎儿,造成各种先天畸形或死亡,而且可使孕妇出现流产、 死产、 早产或增加妊娠合并症,是围产期的一种重要传染病。弓形虫感染可致先天性缺陷问题已引起注意,有将其列为感染性畸形torch综合征的主要位置者6。吕元聪等7调查智力正常儿童组80例,弓形虫阳性6例,阳性率为7150 %;调查弱智儿童及弱智儿童母亲130例,阳性25例,阳性率为19123 % ,揭示儿童智力发育障碍可能与弓形虫感染有关,因此对育龄期妇女和妊娠早期妇女进行常规血清弓形虫抗体检查,这对于有效地降低先天性畸形的发生及保护新生儿的健康有重要现实意义。212 获得性弓形虫病:弓形虫感染以获得性传播占绝大多数,其传播方式有:21211 经肉、 乳、 蛋传播:这些食品如不煮熟,其中弓形虫滋养体或包囊(cyst)未被杀灭,人食用后有可能发生感染。某些工种,如兽医、 厨师、 屠宰场工作人员及家庭妇女等,经常接触动物或生肉,或在处理生肉过程中擦伤皮肤,或在制作过程中舐手指,或因生肉污染食物和饮具,这都可造成感染。此外,在制作肉食过程中,如果温度未达到杀虫要求时,则肌肉中的包囊有可能存活,或在制作过程中,生肉污染其他食品及餐具,人进食污染了的肉食或沾有感染性肉类的餐具时,即有可能引起感染。故认为 “肉 人” 途径以肉中包囊型感染为主。可见,这种包囊 肉 人的传播方式对造成人的弓形虫感染至关重要。生食未煮熟的乳、 蛋感染弓形虫也有文献报告,这些食品如不煮熟,其内弓形虫未被完全杀死,当人们食用时往往造成感染,特别是那些爱吃半生不熟蛋的人,情况尤为突出。实验感染猫、 狗、 山羊、 绵羊、 家兔和豚鼠时,可自其乳中分离出弓形虫;从自然感染的无症状母猪初乳中,分离出弓形虫;吸实验感染小白鼠乳的幼鼠,亦可获得感染。因此,对肉、乳、 蛋进行检查,做好食品卫生及个人卫生,是预防本病的一项重要措施。21212 经猫粪(卵囊)传播:猫及其猫科动物从粪便中排出大量弓形虫卵囊,其抵抗力很强,长期污染环境,成为一个重要的传染源,当人们与之接触时则可发生感染。这种卵囊 环境 人的传播方式值得重视。据有关资料表明,养猫户比不养猫户感染率特别高,吕元聪等8报告广西养猫者感染为6187 % ,而不养猫者仅2129 % ,两者差异非常显著(p 0105)。调查62308人,各年龄组均有阳性,平均阳性率为516 %5,各年龄组阳性率09岁612 %、1019岁610 %、2029岁514 %、3039岁513 %、4049岁513 %、5059岁515 %、6069岁513 %、70岁以上416 %。415 城市与农村:弓形虫感染存在着城乡之间的差别,一般认为农村地区感染率高于城市地区。我们调查城市23092人,阳性1164人,阳性率510 %;农村30557人,阳性2918人,阳性率916 %。城乡有显著性差异(p 0101)5。我国农村居民弓形虫感染率高于城镇的原因,可能与农村居民大多数从事农业、 畜牧业等劳动及家庭饲养猫、 猪等家畜密切接触有关;另外,也与当地农村的生活习惯及卫生状况有05guangxi medical journal ,jan.2002 ,vol.24 ,no.1 1994-2010 china academic journal electronic publishing house. all rights reserved. 关。所以在我国防治弓形虫病的工作,重点应放到农村。5 弓形虫感染与其它疾病的关系511 孕妇弓形虫感染与致畸:关于先天性弓形虫病畸形儿的问题,目前大多数资料证实弓形虫感染与胎儿畸形有关。吕元聪等8报告2718例孕妇弓形虫感染率为315 % ,同时将孕妇弓形虫抗体阳性与阴性分组进行比较研究,发现异常妊娠结局(流产、早产及死胎等)发生在阳性组(1317 %)高于阴性组117 %(p 0101)。邬质彬等10报告在先天性畸形儿中,小脑症、 脑膜脑炎、 脑性瘫痪、 先天性心脏病、癫痫、 脑积水、 智力发育低下等患儿的弓形虫抗体阳性率依次为: 1411 %、40 %、2518 %、25 %、1616 %、1412 %、1215 % ,认为上述先天性畸形等疾病与弓形虫感染有关。在我国推行一对夫妇只生一个小孩的计划生育政策情况下,加强致畸因素的研究和预防工作,以提高生育质量更为重要。512 弓形虫感染与智力发育障碍:大量研究资料显示先天性弓形虫感染与发育障碍存在病因学关系。弓形虫感染可直接影响儿童智力。蒋竹青等1报告,83例由妇幼保健院儿科专业测定,以iq 60为参考,结合临床及生活中简单应答、 计数等因素,认定有智力中、 低度低下的儿童及父母(排除后天因素) ,配对30例因外伤、 手术后遗症等后天因素接受检查的儿童及父母,用iha、elisa系列检测,83例中18例检出弓形虫抗体(2116 %) ,父母同时阳性的10人,占阳性儿童的5516 % ,配对观察的30例中,3例阳性(1010 %) ,or = 2159。吕元聪等7调查正常儿童80例,弓形虫抗体阳性率为715 %;弱智儿童65例,阳性率为1619 %;弱智儿童母亲的阳性率2115 %与智力正常儿童阳性率715 %相比较,差异均有显著性意义(p 0101)。513 精神病与弓形虫感染:弓形虫病与精神疾病的研究,近年来引起了更多的关注。吕元聪等11调查精神疾病患者,精神分裂症、 脑器质性精神障碍及精神发育迟滞者的弓形虫感染率分别为2411 %、2612 %、1816 %、1413 % ,而对照组仅518 %。连达沂等12对134例精神病人作弓形虫iha检测,阳性率2813 % ,健康人群813 %(p0105)。mastrogiannis ds6也认为妊娠晚期各孕周之间- hcg无显著性差异。2 与妊高征的关系在二十世纪三十年代,人们研究了以hcg预测孕晚期妊高征,但做为晚孕胎儿危险性的指标很快被废弃了,主要是因早年的生物学检测方法敏感度极低,且与lh有交叉反应,导致上述研究没有显示有价值的临床意义。自1960年以来,多种高灵敏度的hcg试验方法如放免法、 单克隆抗体法发展普及,孕中、 晚期hcg水平升高与妊高征的关系成为研究热点之一。muller等7在对5776例孕15周妇女进行的研究表明,血hcg与重度妊高征之间存在显著联系,那些后来发展为重度妊高征的妇女在孕15周时hcg升高极明显,以对照组中位数为预报值,敏感性达100 % ,以2倍对照组中位数为预报值时敏感性为32 % ,特异性为10 %。另有报道,不明原因孕中期25guangxi medical journal ,jan.2002 ,vol.24 ,no.1中 国 人 兽 共 患 病 学 报chinese journal of zoonoses2008 , 24 (5)文章编号:1002 - 2694(2008)05 - 0446 - 05弓形虫its21序列pcr诊断方法的建立3邵国青1,杨莉莉1,王继春1,刘茂军1,周勇岐1,孙佩元1,杜改梅2,吴叙苏1,刘冬霞1摘 要:目的 本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性pcr诊断方法。方法 本研究以弓形虫its21序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子dna ,经pcr扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测pcr方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和pcr方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、 肺门淋巴结、 脾脏、 肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果 该pcr方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子dna (相当于10个速殖子的dna) ;鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和pcr方法对人工感染小鼠组织dna的检出率均为87. 5 %(7/ 8) ,对人工感染家兔的检出率分别为50 %(3/ 6)和66. 7 %(4/ 6) ,对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20 % ,两种方法的检查结果基本一致。结论 本试验结果表明,pcr技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。关键词:弓形虫;pcr; its21 中图分类号:r382. 5 文献标识码:aestablishment of upcrassay for diagnosis oftoxoplasma gondiiinfectionshao guo2qing ,yang li2li ,wangji2chun ,liu mao2jun ,zhou yong2qi ,sun pei2yuan ,du gai2mei ,wu xu2su ,liu dong2xia( institute of veterinary science , j iangsu academy of a griculture sciences , n anjing210014, china)abstract:to establish a special pcr assay to detect the presence oftoxoplasma gondii,the 18s25. 8s rrna internaltranscribed spacer21(its21) region was used as the special genetic marker in this test. the tachyzoite dna was diluted by limit2ing dilution assay and after pcr amplification it was used to detect the sensitivity of pcr assay. in order to detect its specifici2ty ,pcr amplification using the same primer pairs was performed with dna from geographic eimeria tenella in chicken andt.dondii. the tissue smear method and pcr assay were simultaneously employed to detect the presence oft. gondiiboth in tis2sues of the experimentally infected mice and rabbits and in the clinical samples including lungs ,brocho2pulmoanry lymph nodes ,spleen ,kidney and liver of 10 pigs with suspected toxoplasmosis ,thus to compare its sensitivity of testing with these two meth2od of assay. it was found that the lowest value to detect thet. gondiidna was 1 pg of tachyzoite dna(equivalent to amountof dna from 10 tachyzoites) ,in which the specific band of 300 bp targeting the its21 region appeared only on dna fromtgondiiand no specific band could be detected with dna from e ,tenella in chicken. the detection rate oft. gondiiby using tis2sue smear method and pcr assay were both 87 5 %(7/ 8) ,but those for tissues from experimentally infected mice and rabbitswere 50 %(3/ 6)and 66. 7 %(4/ 6) respectively. however ,the positive rate of detection fort. gondiiin 10 pigs with suspectedtoxoplasmosis by using tissue smear method and pcr assay both were 20 %. it is evident that the results by using these twokinds of methods to detect the presence oft. gondiiare considerably consistent ,suggesting that the pcr assay can be appliedfor the diagnosis oft. gondiiinfection in animals.key words:toxoplasam gondii; pcr; its213 公益性行业(农业)科研专项经费项目(200803017) ,江苏省自然科学基金重点项目(bk2007711) ,江苏省农业三项工程项目(sx(2007)082)资助 作者单位:1.江苏省农业科学院兽医研究所,南京 210014 ;2.金陵科技学院动物科技学院,南京 210001 ;email : 84391973 163.com 弓形虫病是一种人兽共患病,对世界的畜牧业发展造成一定经济损失,尤其对人群健康具有严重的潜在危害性1。临床上,弓形虫往往与其它病原混合感染,时常出现易混淆的病症,临床诊断、 病原学诊断和iha试验等血清学方法均存在某些局限,这对猪弓形虫病的诊断工作提出了更高的要求。因此,建立一套准确,快速,便于基层推广使用,具有一6442008 , 24 (5)中 国 人 兽 共 患 病 学 报chinese journal of zoonoses定实用意义的诊断方法势在必行。随着分子生物学技术的发展,pcr和dna探针技术开始逐渐出现。pcr方法可以直接检测虫体dna ,能在感染后出现明显症状时检测到虫体特定基因片段,可用于诊断动物的弓形虫现症感染。pcr技术具有敏感性高、 特异性强、 检测迅速和具有早期诊断价值等优点。目前,在伊氏锥虫2、 杜氏利什曼虫3、 肉孢子虫4等原虫病的诊断和检测方面pcr技术均已得到了较为广泛的应用。而有关弓形虫病pcr诊断方法的探索相关研究报道较少。由于its21序列存在于弓形虫整个生活史中,因此相对于一些编码基因,在猪弓形虫病的临床诊断以及猪肉产品的检验方面更具有实用价值。因此,本文以弓形虫its21序列作为种特异性遗传标记,对弓形虫感染的临床病例特异pcr诊断和检测技术的建立进行初步探讨。1 材料和方法1. 1 实验动物 icr系小鼠(2025g) 13只,购自南京医科大学实验动物中心,用于腹腔增殖虫体和人工感染试验;新西兰白兔(2. 5kg) 6只,体温38. 5 39. 5,血检iha12 ,购自江苏省实验动物供应基地。弓形虫国际标准强毒株rh株为南京医科大学病原生物学教研室惠赠。弓形虫nt株为江苏农科院兽医研究所1977年从南京汤山某发病猪场分离获得。两虫株均由本研究室加保护剂于液氮保存。鸡柔嫩艾美耳球虫为本实验室保存的虫种。1. 2 虫体基因组dna的提取及稀释 采用sds碱裂碱法提取虫体基因组dna5。用紫外分光光度计测定所得dna浓度(260nm) ,用超纯水将其稀释到100fg/l , 1pg/l , 10pg/l , 100pg/l ,1ng/l ,10ng/l。1. 3pcr检测敏感性试验 弓形虫its21序列特异引物为: p1 : 5 2gatttgcattcaa gaagcgtgatagtat23, p2 : 5 2agtttaggaa g2caa tctgaaagcacatc23,扩增片段大小为300bp。取弓形虫nt株速殖子dna 100fg/l ,1pg/l ,10 pg/l , 100 pg/l , 1ng/l , 10ng/l各1l作为模板。pcr反应体系为:总体积25l ,taq dna聚合酶0. 125l ,10pcr buffer 2.5l ,mgcl22.5l ,dntp 2.5l ,p1 0.2l ,p2 0. 2l。同时设立阴性对照、 空白对照和宿主对照。pcr扩增条件为:94 预变性5min ,94 变性30s ,55 退火30s ,72延伸30s ,共35个循环,最后72延伸7min。在1. 0 % tbe琼脂糖凝胶上电泳,染色,用j s2380a自动凝胶图像分析仪分析拍照。1. 4pcr检测特异性试验 分别取鸡柔嫩艾美耳球虫dna和弓形虫dna各1l作为模板,引物、pcr反应体系和扩增条件以及凝胶电泳同上。1. 5 人工感染实验动物组织触片法检查 给8只小鼠腹腔接种nt株50万/ ml虫体0. 2ml。视小鼠发病情况,于接种后第4d和第5d剖杀,采集肺脏和肝脏作组织触片,甲醇固定3min后,姬姆萨染色1h ,油镜观察。给6只家兔背部皮下接种n t株10万/ ml 1ml ,于接种后第6d剖杀,采取肺门淋巴结、 肺脏、 肝脏、 脾脏和肾脏作组织触片,甲醇固定3min后,姬姆萨染色1h后用油镜观察。1. 6 人工感染实验动物组织pcr扩增 按照上述虫体基因组dna的提取方法提取人工感染实验小鼠肺脏、 肝脏和家兔肺脏、 肝脏和肺门淋巴结组织dna。 以人工感染小鼠和家兔的肺脏和肝脏组织dna为模板进行pcr扩增,引物、pcr反应体系和扩增条件,以及凝胶电泳均与敏感性试验相同。1. 7 临床病例检测 疑似病猪的判断标准为:皮肤红紫,尤以耳根、 四肢内侧皮肤更加明显,体温升高,呈稽留热,体表淋巴结如腹股沟淋巴结肿大;肺脏间质增宽,肺水肿,肺门淋巴结肿胀出血,肝脏出现白色坏死点,肾脏出血点。猪群发病表现为散发和群发。制作肺门淋巴结、 肺脏、 肝脏、 脾脏和肾脏组织触片,对疑似病猪进行组织触片法检查,将触片甲醇固定后姬姆萨染色1h ,显微镜观察。本试验10头病猪来自南京周边地区以及外省部分地区。1. 8 临床病料基因组dna提取和pcr扩增 依照上述方法提取病猪肺脏、 肺门淋巴结、 肝脏和肾脏组织dna。以病猪肺脏、 肺门淋巴结、 肾脏和肝脏组织dna为模板进行pcr扩增,引物、pcr反应体系、 扩增条件和凝胶电泳与敏感性试验相同。2 结果与分析2. 1pcr检测敏感性试验 结果显示,105,104,103,102和10个弓形虫nt株速殖子的dna以及阳性对照rh株均成功扩增出与预期目的片段大小一致的dna片断,约300 bp ,且无非特异性条带。其中105、104和103个速殖子的dna扩增的条带较亮,而102和10个速殖子的dna扩增的条带较暗,1个速殖子的dna (100fg)未扩增出目的条带,空白对照为阴性。由实验结果得出,该pcr检测方 法最 低 能 够 检 测 到10个 弓形 虫 速 殖 子的dna。2. 2pcr检测特异性试验 结果弓形虫nt株速744中 国 人 兽 共 患 病 学 报chinese journal of zoonoses2008 , 24 (5)殖子的dna扩增到300bp的条带,而鸡柔嫩艾美耳球虫基因组dna经pcr扩增没有得到300bp的条带。2. 3 人工感染动物组织触片检查和pcr检测2. 3. 1 人工感染小鼠 给8只小鼠腹腔接种nt株50万/ ml 0. 2ml后4d剖杀,肺脏和肝脏pcr结果显示,8只小鼠有7份阳性;组织触片法有7份可以看到速殖子。图1所示为随机挑选的1份阳性样品。pcr检测8份样品,其中7份样品及阳性对照(rh)均可扩增出与预期目的its21片段长度一致的片段,约300bp ,且无非特异性条带。其余1份和宿主对照均未扩增出条带。2. 3. 2人工感染家兔 nt株10万/只背部皮下接种6只家兔,肺脏、 肺门淋巴结和肝脏的组织触片结果显示,可以观察到其中的3份材料具有弓形虫速殖子,随机选取阳性材料如图2所示。pcr检测结果显示,有4份材料成功扩增出特异性条带,且无非特异性条带,阳性对照扩增出约300bp的条带。宿主对照为阴性。图1 人工感染鼠肺触片fig. 1lung smear in experimentally infected mice2. 4 临床疑似病猪组织触片检查和pcr检测 对10份疑似病猪进行临床诊断和肺组织触片检查(见表1)。组织触片检察结果显示,有2份可以看到速殖子,呈阳性(图3)。该10份样品的pcr扩增结果显示,10份中有2份可以成功扩增出大小约为300bp的片段,且无非特异性条带,阳性对照扩增出300bp条带。宿主对照呈现阴性。两种方法检测弓形虫人工感染动物的结果如表2所示。表1 弓形虫疑似病猪检测结果table 1detection results of pigs with doubtful toxoplasmosis组织触片肺出血肺萎缩间质肺炎体温升高皮肤发红 淋巴结水肿出血肾出血肝脏出血点江宁-+-+-南京+-+-南京+-+常州-+-+湖北-+湖北-+金坛-+-+-+南京-+-+-+-+浦口-+-安徽六台-+-+总计2/ 105/ 101/ 106/ 109/ 109/ 109/ 106/ 107/ 108442008 , 24 (5)中 国 人 兽 共 患 病 学 报chinese journal of zoonoses表2pcr法和组织触片法检测弓形虫结果table 2detection results oft. gondiiby pcrassay and tis2sue smear感染动物人工感染小鼠 人工感染家兔 临床病猪pcr扩增阳性率87. 5 %66. 7 %20 %组织触片法阳性率87. 5 %50 %20 %63 讨 论 弓形虫病的诊断对于人和动物的健康都具有一定意义。利用粪便学检查方法检查猫粪中卵囊的意义不大,因为需要的检测时间太长。生物样品的组织学检查方法也不是十分有效的方法,该方法常受到动物感染剂量的影响,感染轻微时一般检查不到组织中的速殖子。小鼠接种的方法比较有效,但试验周期较长,至少在接种后34d才可以在外周血中检查到速殖子,不利于快速诊断。细胞培养(ve2ro、 人成纤维上皮细胞)技术需要专门的实验室,而且一旦样本发生自溶,虫体死亡,细胞培养常常失败。血清学方法比较常用,其中,染色试验(dt)和间接荧光抗体试验(ifat)比iha血清学试验,胶乳凝集试验(la)和elisa的敏感性和特异性好。hurtado等通过对弓形虫its21序列设计引物建立了一种巢式pcr方法,用于检测羊组织中的弓形虫,pcr检测的结果与间接荧光抗体试验的结果有良好的相关性6,但后者操作比较繁琐,不利于推广应用。 国内外学者曾采用不同的pcr方法以及使用不同的分子遗传标记进行了弓形虫pcr检测方法的敏感性研究。j . lawrence burg (1989)等用弓形虫b1基因作分子标记建立pcr方法,结果证明,用10个弓形虫速殖子的dna和105个白细胞的dna混合物作为模板, pcr能够检测到b1基因7。james m. macpherson(1993)利用弓形虫rrna小亚基特异引物建立pcr方法,最低检测到0. 1pgdna ,相当于一个弓形虫虫体8。王胜昌等(2003)利用弓形虫p30基因作为遗传标记,设计两对引物,建立了套式pcr检测方法,最低检测到1pg弓形虫dna ,相当于10个弓形虫虫体9。曼谷wiengcharoen j t(2004)采用b1基因为分子标记,建立nested2pcr方法,通过采集羊水,检测怀孕女性是否发生弓形虫感染,该研究将弓形虫速殖子添加到动物羊水中,检测结果显示,41份阳性羊水样本检出30份,所有阴性样品检测结果均为阴性,该pcr方法敏感性为73 % ,特异性为100 %10。根据弓形虫its21序列设计种特异性引物建立猪弓形虫感染的real2time pcr方法,最低可检测出1个弓形虫的dna。众多研究资料表明,rdna序列因其功能上的高度保守性和进化的时钟性,已被越来越多地用于物种分类和遗传进化关系的研究,尤其是物种的种间分类研究。由于rdna中介于18s和28s之间的its具有进化速度快、 长度不大、 在基因组不同单元间一致性好等特点,十分适合进行各种分子操作,因此its序列分析已被广泛用于研究科内属间及属下种间的遗传关系。homan等分析了20株弓形虫的its21序列,20株弓形虫的its21序列完全一致11,表明its21序列与虫株的来源和毒力无关,但与同属于肉孢子科的犬新孢子虫有22 %的差异,利用its21的多态性不但可以对肉孢子科进行科内的种属鉴定,同时也提示,不同科或同一科不同属不同种的原虫,其its21序列存在较大差异,这为利用弓形虫its21序列作为分子标记研究弓形虫pcr检测方法提供了理论依据。本研究用弓形虫its21作为扩增靶基因,设计种特异性引物,进行常规pcr扩增,最低可以检测到10个弓形虫速殖子的dna ,说明该常规pcr扩增技术具有较高的敏感度,与实时定量pcr和巢式pcr相比,更有利于该方法的推广应用。但该方法距目前最低的检测量仍存在差距,因此还需要进一步改良,提高其检测的敏感度。jauregui用弓形虫its21序列特异引物建立的实时定量pcr方法,与其它8种原虫(包括n.caninum,犬新孢子虫;h.hammondi,哈氏哈芒球虫;eimeria acervulina,堆型艾美耳球虫;eimeriatenella,柔嫩艾美耳球虫;cry ptosporidium par2vum,微小隐孢子虫;s arcocystis muris,鼠肉孢子虫;s arcocystis tenella,特南纳住肉孢子虫;s arco2cystis cruzi,枯氏肉孢子虫)均无交叉反应,说明采用弓形虫its21序列建立的pcr方法具有很高的特异性。本试验采用与弓形虫同一目(真球虫目)的艾美耳科的鸡肉嫩艾美耳球虫作对照,验证pcr检测方法的特异性,结果表明,该特异性引物只扩增弓形虫dna ,不扩增鸡柔嫩艾美耳球虫dna ,这与以上的研究结果相一致12。 本研究采用实验室复制弓形虫感染病例的方法,建立动物弓形虫感染模型,模拟自然发病状态,利用已建立的pcr检测方法以及病原学方法对感染动物的组织进行检测。在试验之前进行动物感染的预试验,结果提示,给小鼠和家兔分别接种n t剂量低于100和1000时,接种后4d(鼠)和6d(兔)动物组织中速殖子数目较低或不存在。所以采用弓形944中 国 人 兽 共 患 病 学 报chinese journal of zoonoses2008 , 24 (5)虫nt株10万/只的剂量对小鼠和家兔进行接种,8只感染鼠经病原学检测有7份呈现阳性,pcr检测有7份阳性,该7份材料在病原学检查中均呈阳性结果。6只感染兔的病原学检查有3份呈阳性,此3份在pcr扩增中均出现特异条带。pcr检测阳性率均为66. 7 %(4/ 6)。2种检测方法的阳性结果对应的动物个体完全一致。本试验结果表明,小鼠和家兔分别感染弓形虫4d (鼠)和6d (兔)后,用pcr扩增可以检测到体内组织虫体的its21片段,表明pcr方法对人工感染的小鼠和家兔的检测率比病原学组织触片检测率高。 利用该pcr方法检测临床疑似病猪的组织,结合临床表现,剖解病变,iha血清学检测以及病原学检测结果,判断被检材料是否为弓形虫阳性病料。该试验中送检的病例猪均处于临床症状明显、 剖检变化比较典型的时期。对临床疑似弓形虫病猪检测结果显示,病原学检测阳性率为20 %(2/ 10) ,pcr阳性率为20 %(2/ 10) ,另外,本试验用iha试验对29份临床病猪进行检查,阳性率为17. 24 %(5/ 29)。pcr检测与病原学检查显示阳性的病例猪基本相同,结果基本一致,由此可以断定被检病猪在送检时的弓形虫感染情况。此外,在临床实际中,感染轻微或处于康复期的猪,其肺脏、 肝脏、 脾脏等组织所含虫体随着机体康复而逐渐被清除,此时进行pcr扩增,检出率必将受到一定影响。由此提示,在疾病早期和病发期以及在体温高于正常水平时,对病料进行病原学检查和pcr扩增,有助于提高检出率。参考文献:1sukthana y, kaewkungwal j.toxoplasma gondiiantibody inthai cats and their ownersj. southeast asian j trop med pub2lic health ,2003 ,34(4) :73328.2zulantay i , honores p ,solari a ,et al. use of polymerase chainreaction (pcr) and hybridization
- 温馨提示:
1: 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
2: 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
3.本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
人人文库网所有资源均是用户自行上传分享，仅供网友学习交流，未经上传用户书面授权，请勿作他用。
川公网安备: 51019002004831号