NCBI引物设计方法

1、Primer-Blast 介绍Primer-BLAST在线设计用于聚合酶链反应 （PCR的特异性寡核甘酸引物。Primer-BLAST 可以直接从Blast主页（./）找到，或是直接用下面的链接进入：./tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的 Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。 Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用 Blast进行引物特异性验证。 并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基 因的弓 I物一 an important fea

2、ture for PCR protocols measuring tissue specific expression （注： 没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用 Primer3和NCBI BLASTS加准确。Primer-BLAST 的输入Primer-BLAST界面包括了 Primer3和BLAST勺功能。提交的界面主要包括三个部分：target template （模板区），the primers （引物区），和 specificity check （特异性验证区）。跟 其它的BLAST一样，点击底部的"A

3、dvanced parameters"有更多的参数设置。模板（Template）在"PCR Template'下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用 Accession Numbero如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLASTM会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在 specificity check区选择）是唯一的。引物（Primers） 如果你已经设计好了引物， 要拿来验证引物的好坏。 可以在Primer Parameters区填入你 的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在 specificit

4、y check区选择）。根据 需要可设置产物的大小，Tm值等。特异性（Specificity）4 specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比 较重要的。这里提供了 4 种数据库：RefSeq mRNA, Genome （selected reference assemblies）, Genome （all chromosomes）, and nr （the standard non-redundant database）。 前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标

5、准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies包括以下的物种：human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly,honeybee, Arabidopsis,和rice。Nr数据库覆盖 NCBI所有的物种。实例分析用人尿喀咤 DNA糖基化酶（uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GenelD: 7374）两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1的序列长一点（NM_0033

6、62） , UNG2的序列短一点（NM_080911,注：拿这两个基因的序列ClustalW 一下就可以了）。这里用UNG2的序列设计引物，选择 RefSeq mRNA database物种是Human,其它默认。结果如下图A-B所示，设计的引物只能扩增出UNG2。看上面的图，把"Allow primer to amplifymRNA splice variants”这个选项给勾上，出现的结果如下图-C所示，新的引物也可以扩增出UNG1 （注：我试了一下，不能得到预期的结果，可能参数没设对）。Figure. Primer-BLAST results for UNG transcrip

7、t variant 2. The NCBI Reference sequence NM_080911 was used as a template. Top panel: Primers specific to the single splice variant are reported by default with the mRNA RefSeq database limited to human sequences.Bottom panel: Primers that amplify both splice variants are found with the option to al

8、low splice variants.（点击看大图）一些 Tips1,在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession号（尽量不要Fasta格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填Accession Number时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）2,就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用Gi号或Accession号（Primer-BLASTW参数可以设置设计引物的范围，”Form-To”,如上面的第一幅图所示）。因为用Gi号或Accession号，NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。3,尽量使用没有冗除的

9、数据库（如 refseq_rna或genome database） , nr数据库包括 了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。4,请指定一个或几个 PCRT增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程 序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。参考文献1. Steve Rozen and Helen J. Skaletsky （2000） Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S （eds） Bioinformatics Methods

10、and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386.延伸阅读：1.Blastp/PSI-BLAST/PHI-BLAST勺详细介绍2.NCBI在线blast数据库的简要说明4.Primer Premier5.0 :引物设计软件5.NCBI-LocusLink介绍Categorized |Tags | ,Posted on 30 五月 2009 by 柳城，阅读 2,4041、进入网页：2、点击 Search for short, nearly exact matches3、 在sear

11、ch栏中输入引物系列：注：文献报道 ABCG2勺引物为 5' -CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-5' -TGCCCATCACAACATCA TCT-3(1)输入方法可先输入上游引物，进行程序，同样方法在进行下游引物的程序。 这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列一一之后看两者的交叉。(2)简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系 列都从5' 3'。A、输入上游引物空格 输入下游引物B、输入上游引物 回车 输入下游引物4、 在 options for advanced bla

12、sting 中：select from 栏通过菜单选择 Homo sapiens【ORGN Expect后面的数字改为105、在 format 中：select from 栏通过菜单选择 Homosapiens【ORGN . Expect 后面的数字填上0106、 点击网页中最下面的“ BLAST ”7、 出现新的网页，点击 Format!8、 等待若干秒之后，出现results of BLAST勺网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。(1)图形格式：?图中代表这些与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于4050分?图中代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于4050分，而与下游引

13、物不互补?图中代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配?通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。(2)结果信息概要:preducing nwriiHic&nt al:"37=7门 g 口.二夏55。WQU 第111之口以曲。如芳酬，Horn sapiens，心亨wutt,I HctwATP-binding c我w凄H<tedq lens cicne FLH工目5。廿 t .OIL;, ».Kom sap Lena clon« JAR ELc 5 1BCG2从左到右分别为:A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的

14、信息B、系列的简单描述G 高比值片段对(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式=匹配的碱基x 2+0.1。举例：如果有 20个碱基匹配，则其得分为 40.1。D> E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。 The e value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases 。 E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。 设定的E值是我们限定的上限，

15、E值太高的就不显示了E、最后一栏有的有UEG勺字样，其中:? U代表：Unigene数据库? E代表：GEO profiles 数据库? G代表：Gene数据库(3)结果详细信息：圈出来的部分代表序列的信息第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus 的匹配情况： 共有21个碱基匹配，得分42.1分【21X2+0.1 =42.1,E值为0.020 上游引物与序列的21432163位点匹配第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus 的匹配情况： 共有20个碱基匹配，得分40.1分【20X2+ 0.1 =40.1 ,E值为0.077。 下游引物与该序列的2936029379位点互补注意点：上游引物为20个碱基，为什么会变成21个碱基呢？这是因为下游引物的第一 个碱基为T,刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个 碱基被当成了上游引物了。同理，上游引物的最后一个碱基为G,被当成了下游引物了。通过寻找有没有与120位点、2040位点完全匹配的序列，就可以 避免这个因素的干扰了。为什么与上下游引物匹配的 ABCG存列有多种？? A、为同一个基因来源的不同的 mRN射段? B、 为该基因的DN