细胞培养实验室常见问题

1、细胞培养实验室常见问题1.如何选用培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养 基（SFM）。 2.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 3.L谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养

2、细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I二肽是L谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的氨基用L丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L谷氨酰胺几乎完全降解。5.为什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为PH值的指

3、示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。6.如何用台盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。7.如何消除组织培养的污染？当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染

4、细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，

5、出现空泡，汇合度下降和变圆。4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6)重复步骤4。7)在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。9.Hanks 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液（HBS）和Earles平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平

6、，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point

7、 Determination of Endotoxin Content噬菌体检验生物化学检测激素的检测血红蛋白检测Sf9 细胞生长促进及方法学检测11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100l OPTI-MEM中，稀释DNA在100l OPTI-MEM中。混合两种溶液在室

8、温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800l）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。13.我使用SF900 时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Grac

9、es 液和10%胎牛血清时效果好？如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1），让血清给蛋白酶提供作用底物。 14.如何检测内毒素(热源)水平？LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内

10、酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。） 15.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基

11、的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。16. 20下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。下表列出温度改变10时，PH值的变化情况例如 20下配制PH7.4 Tris缓冲液,40时PH值为 7.4-（2x0.310）6.7817. 室温下(25)配制的Tris-HCl溶液，在37使用时PH值是多少？缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4，25，37时，不同的PH值。18. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产

12、均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.06.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。19. High Five细胞有任何其它名称吗？High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。20.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。 2

13、1.High Five细胞用多大的密度冻存？3.0x10E6 cells/ml 22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。 23.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴氏德

14、吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：1)去除培养基。2) 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.3) 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。4) 37 孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）6) 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。7) 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 24.在Sf9, Sf21,

15、 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 25.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当ES细胞以非常低的密度传入包含10胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。细胞毒分析：当以非常低的密度传入包含30胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。相关形态学和分化分析：检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红

16、，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。26.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。请问在平常的细胞生物学实验中用的磷酸缓冲液常在6.0、6.5、

17、6.8等等这样的范围，常常因为温度等原因，PH值发生了变化，而用PH计又不易测得。这种情况怎么办？如果实验也同样能进行，那么为什么还要规定这么几种值，直接就写在PH值是67之间就好？我很困惑，答：1、在细胞生物学实验中的磷酸缓冲液的PH的确有不同的规定，如6.0、6.2、6.5、6.8等，这些规定是在室温条件下的PH值，在实验过程中，PH值会随温度的变化而变化，但一种缓冲液在不同温度下，缓冲能力是不会改变的；2、我个人的经验，在细胞生物学实验上，磷酸缓冲液PH的不同，主要是许多前辈的经验值，也是实验最佳效果值，我们在实际工作中，PH值有一些偏差，实验也能成立，但达不到最佳效果；3、在配制缓冲液

18、时，一定要确保室温下的准确PH值，如果温度不是室温，可以使用温度校正表，来确定实际的PH值，用便携式PH计可随温度不同自动校正。细胞的原代培养一、原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。二、仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37）材料：胎鼠或新生鼠试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒三、操作步骤（一）胰酶消化

19、法1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡23秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。2、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hanks液洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入56倍的0.25%胰酶液，37中消化2040分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打次，使细胞分离。5、加入35ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。6、静置510分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。7、1000rpm，离

20、心10分钟，弃上清液。8、加入Hanks液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9、加入培养液l2 ml（视细胞量），血球计数板计数。10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37下培养。上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。（二）组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37静置35小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37继续培养。四、注意事

21、项1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。五、无菌操作的几个注意事项1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台

22、面上用品要布局合理。5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。6、吸溶液的吸管等不能混用。附：Hanks液配方：KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4H2O 0.06g，加H2O至 1000ml注：Hanks液可以高压灭菌。4下保存。细胞支原体污染的荧光检测方法DNA萤光染色法 ·原理利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine(A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（5580

23、%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。 ·测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。 ·待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。 ·特点简单、经济与灵敏，广泛使用

24、，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。 ·缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。材料·Hanks balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、gla

25、cial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片浸于酒精内，使用前过火灭菌，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。 ·Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 o

26、r CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。MEM with 10%FB( medium for Vero cell)配制试剂: ·无菌HBSS配制Hanks balanced saltsolution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。 ·Hoechst 33258 stock solution（100X）称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20。 ·Hoechst 3

27、3258 working reagent取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4。 ·mounting solution22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4。 ·固定溶液（fixative）冰醋酸与甲醇以13之体积比例混合，使用前才配制。 步骤： ·培养Vero细胞：

28、Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。 ·在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以12x104 cellsml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37, 5CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。 ·接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下，0.050.1ml冷冻管之细胞悬浮液。 ·将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的萤光染色观

29、察。 ·以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液,负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( MEM +10%FBS)。 DNA萤光染色检测 ·取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。 ·于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30 min。 ·吸掉Hoechst

30、33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。 ·以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。 结果判读若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Ve

31、ro细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。 (A)Negative result 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。 (Positive Result 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。 有关血清使用过程中的问题一有关血清的问题,我们整理了一些实验室里常会遇到的问题,供参考:1.保存血清最好的方法?我们建议血清应保存在-5-20.若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻.2.如何解冻血清才不会使产品质量受损?我们建议您将血清从冷冻箱取出后,先置

32、于2-8冰箱使之溶解,然后在室温下使之全溶.但须注意的是,溶解过程中必须规则地摇晃均匀.3.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,如何处理?血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一.但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量.欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤.我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状物,因为它可能会阻塞您的过滤膜.4.何谓热灭活?有无必要?一般以56、30分钟来处理已解冻的血清,因为此加

33、热步骤,可以使补体去活化,而补体所参与的反应有:溶细胞活性,平滑肌的收缩,肥大细胞和血小板组胺的释放,增强吞噬作用,淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活.实验显示,即使对血清进行正确的热灭活处理,对大多数的细胞而言也是不需要的.经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低.而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是"小黑点",常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者认为是微生物的分裂扩增.因此我们建议您,若非必须

34、,您可以不需要做热处理这一步.如此一来,不但节省您宝贵的时间,更确保您的血清的质量.5.如何避免沉淀物的产生?我们建议您在使用血清的时候,注意正确的血清解冻步骤,并尽量避免灭活血清及长时间的将血清置于高温环境中. 二随着疯牛病和变异性克雅氏病的出现，以牛血清制作培养基生产的疫苗会不会传播疯牛病，成为人们关心的问题。国外权威部门对此的意见是：没有任何证据表明接种疫苗可以传播疯牛病；没有任何证据证实疫苗受到可导致疯牛病的物质的污染；疫苗所用牛血清只在生产的初期阶段用于制作培养基，在成品中该成分已经被稀释为痕量；疫苗传播疯牛病的危险性只是概率极低的理论假说。据外电报道，为确保接种疫苗安全，美国食品与

35、药品管理局(FDA)生物评估和研究中心(CBER)去年专门召开了可传染性海绵状脑病咨询委员会和相关生物制品咨询委员会的联合会议。会议听取了相关研究报告后认为，疫苗传播变异性克雅氏病的可能性是4000万剂分之一至400亿剂分之一，可以说是微乎其微，目前没有任何证据表明接种疫苗制品会发生问题。关于疫苗与牛原材料的任何危险性的猜测只是基于许多假想，没有一个可以确切地量化。今年，国外变异性克雅氏病监测机构的专家对接种疫苗与发生变异性克雅氏病的关系进行了分析。他们根据疯牛病确诊时间及潜伏期推算，认为如果接种疫苗与传播变异性克雅氏病有关，1981年以前出生的人就不应受到感染。但事实上他们分析的52例患者有

36、49例出生在1980年以前，其中半数以上生于1970年前。此外，目前发现的变异性克雅氏病病例绝大多数发生在英国，而疫苗在全世界范围内广泛使用。因此，他们在权威杂志疫苗上发表文章提出，无论从变异性克雅氏病的发病时间还是地理分布分析，均无法证实疫苗传播疯牛病的假说。发现首例疯牛病的布瑞德利爵士，近年已对疯牛病与变异性克雅氏病的相关性进行了大量研究。他将疯牛的血液和其他体液及器官组织直接注入试验动物，让试验动物大量食入疯牛的脑组织，结果发现在牛与牛间传染没有障碍。在小鼠身上造成感染的是疯牛的神经系统组织，而血液、淋巴、骨髓、牛乳及牛脾、胰等都没有造成感染。这个结果得到了世界卫生组织、欧洲药物评审委员

37、会、美国FDA和美国疾病控制中心(CDC)的认同。如何面对疫苗可能导致海绵状脑病的理论假说，美国公共卫生部门(PHS)建议继续推荐免疫程序，接种常规疫苗。欧洲药物评审委员会在今年2月28日发表了关于在疫苗生产中使用牛原性材料发生牛海绵状脑病危险性评估的公开声明，声明说：接种疫苗的益处远远大于疯牛病污染的假设性危险，如果公众对接种疫苗的信心受到破坏而导致免疫接种率降低，将会导致严重危害甚至导致致死性疾病的重新流行。据悉，我国病毒研究、生物制品和疾病控制部门的学者也持此观点。三血清解冻后发现有絮状血清中沉淀物的出现有许多原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性造成的；而血纤维蛋白（形成凝血的蛋

38、白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管中，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。四细胞培养中的支原体污染支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌

39、高。支原体的种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原 （A.laidlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体

40、在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感

41、染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。五 血清热灭活您是否在浪费时间？血清的热灭活是很多培养者感兴趣的话题，价格不菲的血清中含有诸如生长因子，维生素，氨基酸等珍贵物质，而将它们置于50以上的温度长达30分钟是完全没有必要的。尽管如此，在大多数实验室之中血清的热灭活还是作为常规来执行，多数实验者并没有考虑热处理

42、对血清中的生长因子，氨基酸等成分带来的负面影响，在我们的技术热线中最常被提到的就是否该对血清进行热灭活，下面我们就对胎牛血清的热灭活进行一些探讨和解释。根据调查，至少70的研究者对血清的灭活仅仅是因为遵照常规操作，或者说认为是理所当然的。常规灭活建议的温度在45到62之间,而时间则从15分钟到60分钟不等.其中最常用的手法是56热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要。Triglia

43、和Linscott1曾对商业胎牛血清中的补体成分进行测定，他们发现胎牛血清中含有的C1，C6仅达成年动物血清的1-3%，而其它补体成分仅有成年动物的5-50，至于补体的主要成分C3在胎牛血清中则几乎不能检出。通过补体固定实验，我们也在多个不同批次的胎牛血清中获得了相似的结果。即使是在未稀释的血清中，也未发现有明显的溶血现象。另外，多数实验室在培养前将培养液进行预热的过程，也对热敏的补体有灭活的作用。在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。多年以前，450纳米孔径的滤膜被用于加工血清时，血清中支原体的污染时有发生。针对这个问题，HyClone首家使用100纳米三层滤膜

44、连续滤过技术，自从采用这项技术以及后来的40纳米滤过技术之后，我们的血清产品中没有再发现有支原体的污染，也是使得热灭活成为不必要的另外一个原因。Pinyopummintr等证明血清去除灭活步骤不影响牛胚胎的发育分化2；有研究结果3证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用，在用SV-BHK、BALB-3T3、CV1、FS-4细胞对细胞粘附实验中，热灭活对胎牛血清的影响小于对小牛血清的影响。我们调查了热灭活对胎牛血清以及对其中不同细胞株生长能力的影响。通过比较11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株（HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5）的生长带来负面影响，三

45、个细胞株（FOX-NY，MDCK和CHO-K1）不受热灭活的影响，而只有两个细胞株（Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid），在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。在正常操作下，热灭活经常给血清产品带来负面的影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，而导致的沉淀又常常被认为是微生物的污染。注意到这个现象之后，为了验证污染的存在，或者促进沉淀的溶解，许多培养者往往将血清放置37温育。这却往往使情况变得更糟，血清中的蛋白进一步的析出，为了确信血清未被污染，进行的镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验更是浪费了实验者大量的时间

46、和精力。总之，多数细胞培养中血清的热灭活并不是必要的。很多场合下，热灭活并不会改善细胞的生长，却降低了支持细胞生长的能力。即使在少数有促进的情况下，其促进的比率也是微不足道的。另外，血清的热灭活导致的沉淀常常被认为是微生物的污染，从而给用户和供应商都带来不必要的麻烦。我们建议，对于那些对血清进行灭活的用户，需要通过试验来证实其必要性，确定灭活的适当条件；在灭活过程中，需要严格认真监测，并选择一个可重复的方案进行操作。参考文献：1. Triglia, R.P., Linscott, W.D. 1980. Titers of nine complement components, conglutinin andC3binactivatorinadult and fetal bovine sera. Mol. Immunol. 17:741-748.2. Pinyopummintr, T., and Bavister, B.D. 1994.Development of bovine E