检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

1、一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 FRET 技术（in vivo ）FRET, Fluoresce nee resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：400430 nm470480 nm530 nmCFP以下图为例，若要利用 FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合,并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测 GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这

2、两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。读出绿尢（BJ如童口廣脛互咋用（CI逼吕序祁互惟用録色荧丸蚩臼被澈寒隹刪到 酵母双、三杂交技术（in vivo）酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二 个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个 含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵（Bait），将未知蛋白的基因连在 A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋

3、白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵 母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法 在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示:酵母双朵交系统由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用,因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示:如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录(因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用)。将该C端段连到一个膜蛋

4、白上，将 N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠 近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降 解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相 互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示：a5厂J *无蒔录HAS1 理告捷:迴 ：如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表

5、达；当加入第三种成分后，蛋白 X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 Pulldown 技术(in vitro)Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析 的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗岀去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。丿杂蛋白3目的蛋白Pulldown技术利用的是亲和层析技术以及特异的配体（如 GSH或者镍）。以下图为例，将 GST的基因与蛋白X的基因融 合，表达出融合

6、蛋白。将该融合蛋白的溶液过带有GSH配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白的溶液过柱，并让其与融合蛋白反应一段时间。接着开始进行洗脱。如果待测蛋白与蛋白X无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才用抵腮睛:肖iZ走白规合席細下轧甘讲;亍杆輛能在收集到的样品中发现待测蛋白（以及蛋白X），说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用 Far western blot ( in vitro)Far western blot是基于western blot发展而来，其原理如下图所示。将样品蛋白用非变性的PAGE胶分离，然后转膜、封闭、洗膜，加入待测蛋白，使其与已在

7、膜上的样品蛋白进行相互作用。接着加入带有标记（如HRP ）的待测蛋白的抗体反应，最后进行显色（如加入 HRP的底物），观察实验结果。1.用非夷性P威2.峙电棘后的蛋曰进行耨膀3.封闭膜(用昭K或脱脂奶 粉)裁后法屢II6将雀与刁肝凶曲梭一赶聊育，进行显色.获待结乩特膜勻日昂蛋亡的抗怖(舎HRP标记)-同进齐 殍育肛加入待物蛋白.让它 与已在庾丄韵盂自谱 軒相互作用HR?.疑根迂氧化物瞬FAfi WfSTFftN Bl CTtDBle-M 免疫共沉淀(Co-IP ) (in vivo )免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术。它的原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的

8、许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白X的抗体免疫沉淀 X，那么与X在体内有相互作用的蛋白Y也能沉淀下来。Co-IP的原理如下图所示，首先从细胞中提取蛋白质，获得蛋白提取液，并将其与抗体 孵育，使抗体与蛋白 X结合。将预处理过的 protein G琼脂糖珠(Sepharose )加入到抗体 与蛋白提取液的孵育液中反应，使抗体与protein G结合。通过离心将琼脂糖珠沉降到管底， 去除上清液，然后再用缓冲液将琼脂糖珠冲洗数次，最后用western blot (或SDS-PAGE )进行检测。】、检测蛋白质与DNA相互作用 DNA foot printing (in vitro

9、)DNA foot printing的原理如下图所示。将DNA的一个3端用32p标记，然后将DNA分成两份，一份直接用DNase I进行进行电泳，观察电泳结果。下图中，由于待测蛋白与DNA结合的部位无法被DNase I酶切降解，因此它的电泳结果中与直接用DNase I进行处理的样品相比，会缺少一段；如果待测蛋白与DNA无相互作用，那么这两组的电泳结果应当一致。 EMSA(in vitro )EMSA， Electrophoretic Mobility Shift Assay，又称凝胶阻滞实验。其原理是与蛋白质结合的DNA在Native -PAGE胶（非变性胶）上比没有结合蛋白的 DNA移动速率

10、要慢，因此通过电泳即可看到DNA的变化，如下图所示。囲与逅口结合.不客变性 Screen a Phage cDNA-library by DNA probe (in vitro )该方法又成为原位筛选法， 用于检测cDNA文库中的蛋白与DNA探针之间的相互作用。其原理和实验流程如下图所示，首 先是用噬菌体（phage ）侵染大肠杆菌，然后将这些大肠杆菌涂到平板上。接着进行转膜，将膜泡于IPTG水溶液中数小时，然后将该膜放于平板上，培养数小时（IPTG能诱导大肠杆菌表达文库蛋白）。将膜取出，进行变性、复性和封闭（过夜），然后与 放射性标记的DNA探针进行反应，最后洗膜、晾干并用胶片曝光。如果胶片

11、上出现了条带，说明该文库蛋白与DNA探针有相互作用；反之则说明两者无相互作用。Phage cDHA-lIbrarv, ifr导表达： 丸肠杆茵的感染和白合成的诱导*转膜：1PTG水詹浪中浸泡頤酸歼维赦鼾社标记DN A探素朕放在平扳上而，培养也丈小时）针的制备+ /含有噬菌斑的躅讎纤维盍屣瓷桂.复幣和封闭（过疽）、 1结合反总：将滤膜试进含有放射性 标记INA挥针的结令统冲液中，4匸下温和振荡至少1小叶+洗屣后*晾干；胶片曝光 酵母单杂交系统（in vivo ）酵母单杂交系统的原理与双杂交一样，不同的是它主要用于考察cDNA文库中的蛋白与DNA （即特异的已知靶因子）是否有相互作用。其原理如下图所示。首先需要构建一段序列（黑框），它含有至少3个拷贝的特异的已知靶因子以及报告基因的序列