T-RFLP技术在分子分析土壤细菌群落方面的应用

1、Application of Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism for Molecular Analysis of Soil Bacterial Communities T-RFLP技术在分子分析土壤细菌群落方面的应用技术在分子分析土壤细菌群落方面的应用主要内容主要内容lT-RFLP简介简介l实验方法实验方法lT-RFLP在土壤细菌群落其他方面的应用在土壤细菌群落其他方面的应用l结论结论1.T-RFLP简介 T-RFLP是将目标DNA片段的一个末端(通常是5端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限于有荧光标记的末端限制性片段

2、上。酶切后产生长度不等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段的大小和强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样品图谱间波峰的异同，可以为评估土壤微生物多样性提供更敏感的数量化基础，从而为比较土壤样品之间的关系提供一种依据。Fig. 19.2 Examples of T-RFLP profiles obtained after HinfI digestion of amplified 16S rDNA from an agricultural soil (upper chromatogram) an

3、d a heavy-metal rich (serpentine) soil (lower chromatogram). Data Point indicates size range between 20 bp and 500 bp. F.I. Fluorescence intensity Fig. 19.1 Schematic representation of T-RFLP technique. T-RFLP原理图原理图2.实验方法2.1 PCR反应体系 每个PCR反应体系为50l包括：Taq DNA聚合酶稀释缓冲液，1.5 mM MgCl2，10 mM dNTPs，2 units Ta

4、q DNA聚合酶，10 pmol各种引物，1020 ng模版DNA。 95保温保温 1.5 min 94变性变性 30 s 55退火退火 30 s 72延伸延伸 2 min 72最终延伸最终延伸 10 min 95保温保温 1.5 min 95保温保温 1.5 min94变性变性 30 s 94变性变性 30 s60退火退火 30 s 50退火退火 30 s 72延伸延伸 2 min 72延伸延伸 2 min72最终延伸最终延伸 10 min 72最终延伸最终延伸 10 min5个循环个循环25个循环个循环5个循环个循环2.2 PCR反应程序反应程序 2.3 PCR产物检测分析产物检测分析琼脂糖检测PCR扩增产物。专门的工具净化扩增产物。选择性限制酶对扩增产物进行消化。毛细管电泳分离消化后产物。2.4 实验问题分析T-RFLP条带不亮或者16S rDNA扩增很少 检查模版DNA的数量和纯度，检查试剂和PCR反应程序。条带太多或者太少 结合分析不同的限制酶来排除问题。3.T-RFLP在土壤细菌群落其他方面的应用在土壤细菌群落其他方面的应用 T-RFLP可以用于细菌群落表征功能多样性的研究。 T-RFLP也可以用于从土壤中提取RNA和遗传多样性的鉴别。 4.结论结论 l T-R