微生物遗传变异与菌种保藏

1、第八章第八章 微生物遗传变异与菌种保藏微生物遗传变异与菌种保藏本章内容本章内容第一节 遗传的物质基础第二节 基因突变及修复第三节 基因重组第四节 微生物育种第五节 菌种的衰退、复壮及保藏 第一节第一节 遗传的物质基础遗传的物质基础三个经典实验： 转化实验 噬菌体的感染实验 植物病毒的重建实验实验材料：实验方法： 动物实验细菌培养实验S型菌无细胞抽提液试验（一）转化实验（一）转化实验Griffith （1928） Avery（1944）实验材料： 肺炎双球菌光滑型（S）粗糙型（R）有 荚 膜菌落光滑分泌毒素致 病无 荚 膜菌落粗糙无 毒不 致 病SSS三个血清型RRR三个血清型活死死加活R菌或死

2、S菌加活S菌加活R菌和热死S菌抽血分离活的S菌转化实验（1）动物实验?热死 无菌落生长 体外培养 活菌 体外培养 菌落 菌落多菌落少 体外混合培养热死 活菌 说明：加热杀死的S型细菌中可能存在某种物质， 能通过某种方式进入R型细菌。转化实验转化实验（2 2）细菌培养实验细菌培养实验大量R菌落活R菌S菌无细胞抽提液+活R菌+S菌DNAS菌落S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+说明：遗传因子是以DNA为物质基础。转化实验转化实验（3 3）S S型菌无细胞抽提液试型菌无细胞抽提液试验验（二） 噬菌体的感染实验吸附10分钟后搅动离心上清液沉 淀离心,分出上清液和沉淀.沉淀细胞进一步培养，产生大量的子代噬菌体

3、(30% P32、 1%35 ）。证明：在其DNA中，含有包括Pro外壳在内的整套遗传物质。 植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.甲乙r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒 乙甲r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒 （三）（三） 植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 TMV:烟草花叶病毒 HRV:霍氏车前花叶病毒（RNA) 证明遗传物质是RNATMVHRVHRVTMV原始株 拆开 重建 感染 分离纯化 植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 第二节第二节 基因突变及修复基因突变及修复一 基因突变二 DNA损伤的修复一一 基因突变基因突变（一）突变类型（二）

4、突变的特点（一）（一） 突变类型突变类型1 碱基变化与遗传信息的改变2 表型变化1 碱基变化与遗传信息的改变（1） 错义突变（missensemutation）：某个密码的第一个碱基或第二个碱基发生转换或颠换，使编码某一氨基酸的密码变为编码另一个氨基酸的密码。氨基酸置换（2） 无义突变（nonsense mutation）：某个密码的第一个碱基或第二、第三个碱基发生转换或颠换，变为不编码任何氨基酸的密码。终止密码子（UAA,UAG,UGA)。（3） 同义突变（samesense mutation）：发生改变的碱基位于密码的第3位，一般编码同一个氨基酸。比如简并密码。编码的氨基酸与野生型氨基酸相

5、同。（4） 移码突变（frameshift mutation）：DNA序列中1-2个核苷酸缺失或插入，翻译的阅读框改变，导致氨基酸序列改变。2 表型变化（1）营养缺陷型（2）抗药性突变型（3）条件致死突变型（4）形态突变型（1）营养缺陷型(auxotroph) 由于代谢障碍成为必须添加某种物质才能生长的突变株。 腺嘌呤突变株Ade -（完全培养基） 腺嘌呤野生型菌株Ade +（基本培养基和完全培养基）。 营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育 种的重要手段。 用影印平板进行分离筛选。完全培养基基本培养基完全培养基（2）抗药性突变型（resistant mutant)由于基因突变使菌株

6、对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的一种突变型。在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。 在某一条件下具有致死效应，在另一条件下没有致死效应。 合成关键性酶的基因发生了突变。 如温度敏感突变ts（42致死，2530存活）。 用影印平板进行分离筛选。 （3）条件致死突变型（conditional lethal mutant）细胞形态突变 菌落形态突变颜色突变噬菌斑形态突变（4） 形态突变型（morphological mutant）包括（二）（二） 突变的特点突变的特点1 非对应性：环境与变异无对应性。 2 自发性：非人为的诱变因素下发生。3 规律性：某一特定性的突变率具规律性。4

7、 独立性：一个基因的突变对其它基因突变无影响。5 稀有性：生物自发突变率为10-610-12。 6 诱变性：诱变剂可提高突变率10105。 7 稳定性：突变性状稳定、可遗传。 8 可逆性：有回复突变。二二 DNA损伤及修复（自学）损伤及修复（自学）1 光复活作用（Photoreactivation）2 切除修复（Excision Repair）3 重组修复（Recombination Repair）4 SOS修复（SOS Repair）光复活作用（光复活作用（PhotoreactivationPhotoreactivation）Thymine DimerPhotoreactivation光解酶

8、Phr在黑暗中专一地识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成酶-DNA复合物，当有光时，酶利用光能将二聚体拆开，恢复原状，酶再释放出来。正常可见光下光诱导系统的修复。photoreactivation enzyme光裂合酶photolyase烷基转移酶Alkyltransferases切割嘧啶二聚体，分开。胸腺嘧啶二聚体光复活酶可见光 光的吸收酶的释放光复活过程第三节第三节 基因重组基因重组一、原核生物的基因重组 二、真核生物的基因重组基因重组 把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传 物质重新组合后，形成新遗传型个体的方式。 基因重组分子水平的杂交 一般杂交细胞水平如： 甲 乙生长快、产量低

9、 生长慢、产量高 基因重组 生长快、产量高一一 原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组（一）转化（transformation)（二）转导(transduction) （三）接合(conjugation)（一）转化（一）转化（transformation)transformation)概念 受体细胞(receptor)直接吸收来自供体细胞(donor)的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。 1. 感受态2. 感受态因子3. 转化因子4. 转化的特点 （1）感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化 的一种生理状态。 （2）转化的决定因素：不同

10、菌株的亲缘关系;受体细胞是否 处于感受态；不同菌出现感受态的时 间不同。 （3）感受态的获得：自然获得；用CaCl2处理细胞；电穿孔1. 感受态 细菌自身分泌的一种胞外蛋白质，分子量为510kD。 其作用为： （1）催化转化，促进外来DNA片段吸收。 （2）可降解细胞表面某种成分，使DNA受体暴露。 不同菌细胞DNA受体位点不同。 有的菌感受态因子只对同种菌起作用。 2. 感受态因子3. 转化因子（1） 转化因子由供体提供。（2） 一般为线状或闭合环状；单链或双链；双链 有转化能力，单链没有。（3） 自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生；实验室里 通过提取获得。（4） 转化的频率往往很低，一般为

11、0.11%。据研究， 呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转 化频率最高。 游离的片断叫转化因子。4. 转化的特点转化的特点不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。在细菌的感受态出现时，具有从周围环境吸收DNA分子而不被DNA酶破坏的生理特性。处于感受态的细胞，吸收DNA的能力有时可比一般细胞大1000倍。（二）二） 转导转导( (transduction)transduction)以温和噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA或RNA片断转移到受体细胞中，从而使后者获得前者的部分遗传性状。不需要细胞间直接接触。但需要媒介。 普遍转导（Generalized Transductio

12、n） 噬菌体可以转导供体染色体的任何部分到受体细胞中。 局限转导（Specialized Transduction） 噬菌体总是携带同样的片段到受体细胞中。结果10-5频率出现野生型菌株。（基本培养基） U型管试验：也能出现野生型菌株 （基本培养基）在对鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株的研究中发现A+B-A-B+A+B+A+B+供体A-B+A+B-多数受体形成溶源菌A-B+A+B-少数受体A+B+经重组形成转导子A:组氨酸B:色氨酸Generalized TransductionSpecialized Transduction 被转导的基因与噬菌体DNA共价连接，与噬菌体 DNA一起进行复制包装以

13、及导入受体细胞。 噬菌体携带特殊的染色体片段将固定的个别基因导 入受体。普遍转导和局限转导的不同之处：Specialized Transduction原噬菌体供体DNA 受体DNA（三）接合三）接合( (conjugation)conjugation) 概念：供体细胞与受体细胞直接接触，借性菌毛 传递大段DNA的过程。在受体细胞中发生交 换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的 现象，称为接合。 通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。+A+B+C-D-A-B-C+D+接 合 及 其 发 现（大肠杆菌）A+B+C+D+A:生物素B:甲硫氨酸C:苏氨酸D:赖氨酸基本培养基A+B+C-D-A-B-C

14、+D+Davis（1950）U型管试验两个菌株不能直接接触，只能是培养液和营养物质（包括DNA分子）可以通过。 完全培养基完全培养基A+B+C-D-A-B-C+D+基本培养基没有菌生长1. F+与F-杂交F+细菌的表面有称作性菌毛（sex pili）的细长菌毛，由此与F细菌接合，一旦接触后，菌毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道-细胞质桥或称结合管（conjugation tube），F+细胞的F因子通过接合管向F细胞转递： 使F变成F，F因子还可改变细胞表面的构造，以防F细胞间的接合。F+细菌：含有F因子F-细菌：不含有F因子F因子就是F质粒 。滚环式复制， 式 2. HfrF-杂交Hfr菌

15、的形成 F质粒整合到细菌染色体上。质粒和染色体共有插入序列和转座因子。这些转座因子之间的同源重组导致质粒的整合。HfrF-杂交结果仍是Hfr细胞和F-细胞。Hfr和F+的联系和区别 联系：（1）都是雄性菌，含有F质粒。 （2）Hfr F质粒与染色体整合 。 F+ F质粒游离在染色体外。区别：（1） Hfr 的F质粒转移频率低， F+ 的F质粒转移频率高； （2） Hfr 的F质粒整合， F+ 的F质粒游离。 3. F 转导携带有宿主染色体基因的F因子。从Hfr菌中染色体上脱离下来的F质粒有时会携带相邻的染色体基因或DNA片段，称为F质粒（F因子），该菌被称为F菌。F因子 给体的部分染色体基因

16、随F一起转入受体细胞。 基因不需整合就可表达。 利用F 因子形成部分二 倍体叫做性导 sexduction。FF-杂交注意区别F+菌、 Hfr 菌、 F 菌的不同！转化、转导、接合三者的根本区别转化、转导、接合三者的根本区别在于在于DNADNA转移的方式不同转移的方式不同转化：供体DNA片断注入受体细胞，通过细胞膜接合：供体进入受体通过性菌毛。转导：供体DNA片断通过媒介噬菌体携带进入受体。 二二 真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组（一）有性生殖（二）准性生殖（parasexual hybridization）（三）酵母菌的接合型遗传（一）（一） 有性生殖有性生殖 一般指性细胞间的接合和

17、随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种生殖方式。 凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物有性生殖相似的方法进行有性繁殖。一部分真菌的减数分裂发生在1个闭合的子囊壳中，具较短的生活周期，为遗传重组的研究带来极大方便。子囊孢子形成过程粗糙脉胞霉：1个子囊内产生的双倍体核直接减数分裂后所产生的4个孢子直线排列在子囊内（为顺序排列四分体），再进行一次有丝分裂，产生8个子囊孢子。AAAAaaaa、aaaaAAAA、AAaaAAaaaaAAaaAA、AAaaaaAA、aaAAAAaa8个子囊孢子的排列：粗糙脉胞霉（面包霉）的生活史分生孢子（n）菌丝（n）子实体核融合合子核(

18、2n)交配型A交配型B减数分裂I减数分裂II有丝分裂萌发(n)子囊孢子（n）粗糙脉胞霉减数分裂（二）准性生殖（二）准性生殖（parasexual reproduction）1. 准性生殖2. 准性生殖的意义3. 过程 1 准性生殖准性生殖同种异株的两个体细胞融合，不经减数分裂而导致低频基因重组发生的一种繁殖方式。（单倍体体细胞重组）准性生殖与有性生殖的不同： 重组体细胞和一般营养体细胞外形没有不同， 不产生在特殊的囊器中。 染色体的交换及单倍体化过程没有规律性。2 准性生殖的意义准性生殖的意义 对一些没有有性过程但有重要生产价 值的半知菌来说，进行基因在染色体 上定性研究、杂交育种，准性生殖提

19、 供了一个重要的手段。 发现存在于构巢曲菌、米曲菌、青霉 等真菌和放线菌中，使之有普遍意义。3 准性生殖的过程准性生殖的过程（1）菌丝联结（anastomosis）; （2）形成异核体（heterocaryon）; 细胞质、细胞核交流形成异核菌丝体。（3）核配（caryogamy)形成杂合二倍体; 特点：频率低，10-510-7 促成：樟脑熏蒸、紫外、高温。 （4）体细胞交换和单倍体化异核体 同时具有二种或二种以上不同基因型核在同一细胞质中，这种现象又叫异核现象。同核体 同一菌丝中只有一种核。 体细胞交换和单倍体化 体细胞交换： 杂合二倍体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂 的过程中，能发生体

20、细胞染色体间的交换、分离 （单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子。 单倍体化： 在一系列有丝分裂过程中一再发生的个别染色体减 半，直至最后形成单倍体的过程。 （三）酵母菌的接合型遗传酵母菌以单倍体或二倍体的状态存在。单倍体：a细胞或细胞，或称a接合型，接合型。二倍体： a细胞和细胞融合形成二倍体细胞。接合型遗传： a细胞 细胞的转变。盒式机制转变。启动子沉默状态沉默状态a基因表达。a型细胞。盒式机制转变在于 MAT活性区的调控作用第四节第四节 微生物育种微生物育种一 诱变育种二 营养缺陷型的筛选三 原生质体融合一一 诱变育种诱变育种1、概念2、诱变剂3. 诱变程序4、诱变的主要环节1 1、

21、概念、概念诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。2 诱变剂诱变剂（1） 概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。 （2） 种类： 1）物理因子（phisical agents) 物理诱变剂：U.V、快中子、超声波等。 2）化学因子(chemical agents) 化学诱变剂化学诱变剂 碱基修饰剂 如：羟胺、氮芥、硫酸二乙酯（DES）、亚硝基胍（NTG） 机制：对碱基做修饰，改变碱基的配对性质。 碱基类似物 如：叠氮胸腺嘧啶（AIT）、5-溴尿嘧啶（5-UB）、 2-氨基嘌呤（2AP）等。 机

22、制：在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中，而碱基 类似物存在正常状态和稀有状态的转变，在DNA 复制时出现突变体。插入剂 (intercalating agents): 如：溴化乙锭、吖啶橙等一些三环分子。 机制：在形态上类似于碱基对的扁平分子。它们插入DNA分子的碱基对之间，使其分开，导致DNA在复制过程中的滑动，引起移码突变。 与胞嘧啶反应，加上羟基（-OH），对胞嘧啶加以修饰。修饰后的胞嘧啶类似胸腺嘧啶T。C G 羟基化的胞嘧啶 A诱发CG到TA的转换突变碱基修饰剂-羟胺碱基类似物5-溴尿嘧啶（5BU）正常状态：类似胸腺嘧啶，与腺嘌呤配对。 A 5BU A T下一轮复制稀有状态：类似胞

23、嘧啶，只与鸟嘌呤配对。 G 5BU G C下一轮复制正常状态和稀有状态可以相互转换B DNA分子吸收稀有状态的5BU G 5BU A TDNA复制转换成正常状态（G C）（取代G C）A DNA分子吸收正常状态的5BU A 5BU G CDNA复制转换成稀有状态（A T）（取代A T）碱基类似物5-溴尿嘧啶（5BU）图示 (a) 增加碱基 插入剂分子 模板链 5 ATCAG TTACT3 新合成链 3TAGTC G AATGA5 068nm 随机选择碱基 嵌入插入剂处 下一轮复制 5 ATCAG C TTACT 3 3TAGTC G AATGA 5(b)缺失碱基 模板链 5 ATCAG T T

24、ACT3 新合成链 3TAGTC ATGA5 插入剂失去 后复制 插入剂 5 ATCAGTACT 3 3TAGTCATGA 5 图 21-15 插入突变导制碱基的增加(a)和减少(b) 3 诱变程序诱变程序 原始菌种 原菌种特性鉴定 纯化 斜面/肉汤 培养单孢子/单细胞悬液 诱变剂处理 计算存活率 平板分离 观察形态变异，挑单菌落 移至斜面 初筛 复筛 小试 良种保藏 中试4 诱变的主要环节诱变的主要环节（1）诱变剂的选择（2）出发菌株的选择（3）单孢子或单细胞悬液的制备（4）设计和采用效率高的筛选方案和方法 （1）诱变剂的选择： 1）了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法。 2）处理方式 单一

25、因子处理：先后使用。 复合因子处理：两种以上因素同时使用、单一 因子重复使用。 3）处理剂量：测致死率。 方法：平板菌落计数法 一般杀菌率为70%左右。 （2）出发菌株： 育种的原始菌种应具备： 对诱变剂的敏感性高； 生产中选育过的自发变异菌株； 本身具有一些有利性状； 对代谢产物有一定积累； 已经发生过某些变异。（3）单孢子或单细胞悬液的制备 1）必要性：单细胞可均匀地接触诱变剂，避免出现不 纯的菌落菌种退化。 2）制备： 物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液。 3）方法：三角瓶内加0.5cm玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂，用无菌脱脂棉过 滤

26、）。 4）浓度：细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml （4）设计和采用效率高的筛选方案和方法 1）初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株的 生理效应范围。 方法 梯度平板法（抗性菌株） 纸片法（抗性菌株） 透明圈法（淀粉酶产生菌株等） 变色圈法（氨基酸生产菌株） 2）复筛： 较精确的生物化学分析方法做摇瓶测定 二二 营养缺陷型的筛选营养缺陷型的筛选（一）概念（二）筛选方法（三）应用 （一）（一） 概念概念1. 三种遗传型个体2、筛选用的培养基 1 三种遗传型个体三种遗传型个体（1）营养缺陷型（auxotroph）： 经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养 基

27、内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。 如：Lys- ; Bio-（2）野生型(wild type)： 自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突 变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：Lys+； Bio+（3）原养型 (prototroph) ： 指auxo突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野 生型的表型相同。 2 筛选用的培养基筛选用的培养基1）基本培养基（minimal medium,MM）-： 仅能满足野生型菌株营养要求的培养基。2）完全培养基（complete medium,CM）+： 满足一切auxotroph生长的天然或半组合培养基。3）补充培养基（supplemen

28、ted medium,SM） x： 在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相 应auxotroph生长的组合培养基。（二）筛选方法（二）筛选方法auxotroph的筛选程序：筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。 细菌培养 离心洗涤 诱变处理 在CM上培养 洗涤 MM培养（加青霉 素等筛选剂） 涂布于CM平板 影印 培养 挑取 鉴定 菌种保存。完全培养基基本培养基完全培养基（三）（三） auxotroph的应用的应用（1）作为标记菌株： 研究代谢、菌种杂交、重组育种和利用基因工 程进行育种时带有特定基因标记的亲本菌。（2）作为生产菌种：氨基酸、核苷酸等生产菌种；（

29、3）作为氨基酸、维生素、碱基等物质生物测定的 实验菌种。三三 原生质体融合原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion） 使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融 合，并发生遗传重组以产生融合子（fusant） 的过程。 已成功地应用于真菌细胞和植物细胞的属间和 科间的远缘细胞融合，融合产物含两亲代细胞 基因组。1 原生质体的制备2 原生质体融合和再生3 融合子的选择1 1 原生质体的制备原生质体的制备1）选择两个亲本菌株。 细菌用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶。2）酶处理破坏细胞壁，使原生质流出。制备用培养基：高渗缓冲液或培养基。2 2 原生质体融合和再生原

30、生质体融合和再生1）原生质体融合 化学因子诱导：聚乙二醇（polyethyeneglycol，PEG） 并加入Ca 2+、Mg 2+等阳离子 电场诱导：电极极化原生质体成偶极子，沿电力线 排列成串，电流脉冲，原生质体膜被击 穿，融合。2）原生质体再生 在再生培养基上再生。 再生率0.几%几%.3 3 融合子的选择融合子的选择营养缺陷型标记选择 依靠在选择培养基上的遗传标记，有两个遗传标记互补，可确定为融合子。抗药性标记。第五节第五节 菌种的衰退、复壮及保藏菌种的衰退、复壮及保藏 一、菌种的衰退和复壮 二、菌种保藏一、菌种的衰退和复壮一、菌种的衰退和复壮（一）衰退（二）防止衰退的方法（三）菌种的

31、复壮（一）衰退（一）衰退1、概念：菌种经长期的人工培养或保藏,在其自 发突变的影响下，引起某些优良性状 变弱或消失的现象，称为衰退。 2、现象 （1）菌落和细胞形态的改变；（2）生长速度缓慢，产孢子越来越少；（3）代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降； （4）抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 基因负突变不利突变（1）多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏 细菌：1个月 酵母菌：3个月 放线菌、霉菌、芽孢：半年（2） 培养条件；（3） 诱变时出现不纯菌落。3、衰退的原因（二）防止衰退的方法（二）防止衰退的方法 1、控制传代次数； 2、选择合适的培养条件； 3、采用不同类型的细胞进行传代； 4、采用有效的菌种保藏方法。（三）菌种的复壮（三）菌种的复壮1 复壮：使衰退的菌种恢复原来优良性状的 方法。2 复壮的方法： （1）纯种分离： 菌落纯（划线法、涂布法、倾注法） 菌株纯（单细胞挑取法） （2）通过寄主体进行复壮； （3）淘汰已衰退的个体。二、菌种保藏二、菌种保藏（一）目的（二）原理（三）方法（一）目的（一）目的1、存活，不丢失，不污染 2、防止优良性状丧失 3、随时为生产、科研提供优良菌种 创造一定条件，尽可能降低微生物代谢活动强度，使之基本上处于休眠状态。条件：1）挑选优良纯种的休眠体；2）创造适合长期休眠的环境条件（干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等）（二