DNS法测定α淀粉酶活力的方法

1、目的要求 了解生物学研究中针对糖含量测定的常用方法及相关原理。 掌握一般标准曲线制作的意义及要求。 掌握DNS比色法测定-淀粉酶活力的原理、方法及操作步骤。 掌握利用EXCEL分析工具库数据分析回归分析，得到回归方程及相关分析结果。生物学研究中关于糖测定中常用的方法 菲林试剂滴定还原糖，常量分析 DNS比色法还原糖，微量分析 蒽酮比色法总糖，微量分析配制系列浓度稀释液的方法 线性稀释稀释液的浓度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0）； 对数稀释（倍数稀释）系列溶液的浓度比是一常数，取决于稀释梯度2倍稀释（1、1/2、1/4、1/8）；10倍稀释（1、1/10、1/100、1

2、/1000）； 调和浓度稀释系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4，1/5）。-淀粉酶酶活力测定的原理底物（反应物）为淀粉碘比色法（反应一定量淀粉为糊精的时间）产物为麦芽糖、糊精等麦芽糖为还原糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生成量（如DNS法），从而计算出酶活力单位。DNS试剂测定还原糖的原理 淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下： 酶活力测定（DNS比色法） 酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。 注意：去除

3、-淀粉酶的干扰（ -淀粉酶不热耐，在7015min钝化 ）植物材料来源需要注意。本此实验中忽略不计。 检测的原理： 酶解的产物之一麦芽糖具有还原性，可以使试剂中的3，5-二硝基水杨酸还原，形成红色的物质，在540nm下有吸收峰，并和浓度呈一定线性关系。 计算公式：根据标准曲线计算。3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂配制说明 21g 氢氧化钠（先加入溶解）； 182g 酒石酸钾钠（同上）； 6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加热完全溶于上述溶液中； 5g 重蒸苯酚（冷却后加入）； 5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）； 完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越长越稳定。 引自： 朱俭，曹凯鸣

4、，周润琦，蔡武城，袁厚积编著生物化学实验上海：上海科学技术出版社，1981标准曲线法标准曲线法取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处（通常为maxmax），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度（ODOD）为纵坐标，系列标准溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线标准曲线（工作曲线）。理想的标准曲线满足以下条件： 1 1、至少5 5个点，一般不超过7 7个点； 2 2、2 2个以上重复值； 3 3、重复值误差小于5%5%； 4 4、点与线的垂直距总和最小；注意：标准曲线不能任意延长！（有一定测定范围）理想标准曲线的特点 过原点的直线； 斜率为1 1（4545）； 浓度为

5、待测物质浓度的一半二倍； ODOD值在0.050.050.80.8之间（最好控制在0.2 0.2 0.60.6）。mg/ml麦芽糖标准曲线的制作 取6支干净的具塞刻度25mL比色管，编号，按下表中加入相关试剂； 混匀后，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至25mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量（mg）为横坐标，吸光度（OD）为纵坐标，绘制标准曲线。沸水浴时不要加塞！ 利用Excel中相关统计分析工具，完成回归方程的计算及分析，并绘制标准曲线图。相关试剂（第一种） 标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至

6、1000mL。 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸（C6H8O7H2O ）5.78g，柠檬酸钠（Na3C6H5O72H2O）21.32g ，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。 1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉（105烘干2hr）溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中（一般需要密封121.3 灭菌处理20min）。相关试剂（第二种） 标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取1g麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。 0.2mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g，柠檬酸（C6H8O

7、7H2O ）7.74g，先在烧杯中用蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000mL。 1%马铃薯淀粉溶液：称取1g马铃薯淀粉（105烘干2hr）溶于100mL 0.2mol/L pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中（一般需要密封121.3 灭菌处理20min）。用时注意酶污染。标准曲线制作相关试剂加入表加入完成混匀后沸水浴加入完成混匀后沸水浴5min，定容至，定容至25mL混匀比色。混匀比色。预留发酵液酶活力测定需要稀释倍数 10、100、1000、10000、50000 对照设置1个就可以，10或100倍； 按照DNS方法测定。酶活力测定步骤（流程）计算公式10N）U/mL（-麦芽糖毫

8、克数淀粉酶酶活力 N-酶液稀释倍数 10-反应时间为10min 注意：标准曲线、酶活力比色测定时使用玻璃比色皿（可见光比色）预留发酵液紫外分光光度法测定蛋白质含量的稀释要求 酶溶化后稀释至50100倍测定A280和A260；以蒸馏水为对照。 代入Lowry-Kalckar经验公式： 蛋白质含量（mg/mL）=（1.45A2800.74A260）N 注意：使用石英比色皿测定（紫外光比色用？），石英比色皿较贵，损坏要赔偿！比酶活力计算 定义：1mg蛋白质的酶活力单位。 计算公式：（mg）（U）mL）/（U蛋白质含量蛋白质含量酶活力单位酶活力单位比酶活力比酶活力分光光度计介绍 原理：在一定条件下，遵

9、循朗伯比尔（Lambert-Beer）定律 组成：光源、单色器（棱镜、光栅）、吸收池、检测器（光电管、光电倍增管、光电二极管阵列）、显示系统 光源单色器吸收池检测器显示系统朗伯比尔定律朗伯比尔定律朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律bI0I0ITIlgAT I0：入射光强度I：透过光强度AbAcAKbc朗伯比尔定律朗伯比尔定律朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律0lgIAbcI A：吸光度；对光的吸收程度：吸光度；对光的吸收程度 b：液层厚度，单位：液层厚度，单位cm c：溶液的浓度，：溶液的浓度，molL-：摩尔吸收系数，：摩尔吸收系数，Lmol-cm-如果如果c单位：单位：gL-则吸收系数为则吸收系数

10、为a，单位：单位：Lg-cm-的特点的特点=f ()定律适用单色光标志灵敏度标准曲线制作相关试剂加入表加入完成混匀后沸水浴加入完成混匀后沸水浴5min，定容至，定容至25mL混匀比色。混匀比色。酶活力测定步骤（流程）分光光度计介绍 原理：在一定条件下，遵循朗伯比尔（Lambert-Beer）定律 组成：光源、单色器（棱镜、光栅）、吸收池、检测器（光电管、光电倍增管、光电二极管阵列）、显示系统 光源单色器吸收池检测器显示系统朗伯比尔定律朗伯比尔定律朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律bI0I0ITIlgAT I0：入射光强度I：透过光强度AbAcAKbc朗伯比尔定律朗伯比尔定律朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律0lgI