基因工程基础知识

1、第一章基因工程第一节基因工程概述,基因工程的概念aa操作环境aa操作对象aa操作水平aa根本过程aa结果aa生物体外aa基因aa分子水平aa剪切-拼接-导入-表达aa人类需要的基因产物由于基因工程是在 DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术.二.基因工程的根本工具一“分子手术刀一一 限制性核酸内切酶 简称限制酶1 .来源：主要是从 原核生物中别离纯化出来的. 2 .功能：能够识别双链 DNA分子的某种 特定的核甘酸序列,并且使每一条链中特定部位的两 个核甘酸之间的 磷酸二酯键 断开. 3 .结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端 和平末端. 二“分子针线 一

2、一DNA连接酶 1.分类：根据酶的来源不同,可分为 E - coliDNA连接酶和TDNA连接酶两类 42,功能：恢复 被限制酶切开了的两个核甘酸之间的磷酸二酯键.两种DNA连接酶E coliDNA连接酶和TDNA连接酶的比拟：4相同点：都缝合磷酸二酯 键区别：E. coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能使黏性末端 之间连接； TDNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端之间的效率较低.4*DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比拟aaaaa连接酶DNAaaa聚合酶DNAaa不同点aa连接的DNA aaa链双aaa链单aa模板aaa模板不要aaa模板要aa连接的对象 aaaaa片段 DNA2个aaa

3、a片段上 DNA单 个脱氧核 甘酸加到 已存在的 单链aa相同点 aa作用实质aaa磷酸二,酯键形成aa化学本质aa蛋白质三“分子运输车一一 载体一体细胞中并片段插入；- 1.载体具备的条件：；稳定保存 复制能在受DNA限制酶切割位点具有一至多个,供外源 的鉴定和选择. DNA标记基因 具有,供重组 等. 动、植物病毒和噬菌体、质粒基因工程常用的载体有：2.,它是细菌细胞中的一种很小的双链质粒最早应用的载体是 分子.DNA环状三.基因工程的根本过程一获得目的基因目的基因的获取1 .获取方法主要有两种：从自然界中已有的物种中别离出来,如可从基因文库中获取.用人工的方法合成.获得原核细胞的目的基因

4、可采取直接别离,获取真核细胞的目的基因一般是人工合成人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法.2 .利用PCR技术扩增目的基因（1） PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术.2目的：获取大量的目的基因3原理：DNA双链复制 4过程：第一步：加热至 9095CDNA解链为单链； 第二步：冷却到 5560 C,引物与两条单链 DNA结合； 第三步：加热至 7075 C,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成.5特点：指数形式扩增二制备重组DNA分子基因表达载体的构建1 .重组DNA分子的组成：除了目的基因外,还必须有标记基因.标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否

5、含有目的基因,从而将 含有目的基因的细胞 筛选出来.2 .方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因,再用DNA连接酶把两者连接. 三转化受体细胞将目的基因导入受体细胞1 .转化的概念：是目的基因进入受体细胞内, 并且在受体细胞内 维持稳定和表达的过程. 2 .常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术农杆菌转化法,其次还有基因枪介导转化技术基因枪法和花粉管通道技术花粉管通道法.将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术.此方法的受体细胞多是 受精卵将目的基因导入微生物细胞：Ca+处理法. 四筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达目的

6、基因的检测与鉴定1 .首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用 DNA分子杂交 技 术.2 .其次还要检测目的基因是否 转录出mRNA ,方法是采用 DNA分子杂交 技术.3 .最后检测目的基因是否译成蛋白质,方法是采用抗原一抗体杂交技术.4 .有时还需进行个体生物学水平的鉴定.如抗虫或抗病的鉴定等.第二节基因工程的应用1 .运用基因工程改进动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限,基因工程的应用 2.(1)植物基因工程：抗 虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改进植物的品质.(2)动物基因工程：提升动物生长速度来提升产品产量、改善产品品质,用

7、转基因动物生产 药物,用转基因动物作器官移植的 供体等.(3)基因诊断和基因治疗：基因诊断：又称为 DNA诊断,是采用 基因检测 的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体.基因治疗：指利用 正常基因 置换或弥补缺陷基因的治疗方法. 实例：ADA基因缺陷症的基因治疗第三节蛋白质工程1 .蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能 之间的关系,通过 改造基因,以定向改造天然蛋白质,甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质.2 .蛋白质工程的根本原理预期蛋白质功能-测定蛋白质三维空间结构-推测应有的氨基酸序列-找到对应的脱氧核甘酸序列(基因)f具有预期功能的蛋白质 3 .蛋白质工程的应用(1

8、)通过改造酶的结构,有目的地提升蛋白质的热稳定性.(2)合成嵌合抗体.(3)改变蛋白质的活性.蛋白质工程与基因工程区别aaa蛋白质工程aa基因工程aa实质aaaaa质,甚至创造自然界不存在的蛋白质改造基因通过,以te向改造天然蛋白aaaaa受体细胞 中表达从供 体转移到受 体细胞,并 在目的基因 将aa结果 aaaa的蛋白质 不存在合成自然界aaaa的蛋白质只 能生产自然 界已存在aa联系 aaaa蛋白质工程是在基因工程根底上,延伸出的第二代基因工程细胞工程一植物细胞工程1 .理论根底原理：细胞全能性 全能性表达的难易程度： 受精卵生殖细胞干细胞 体细胞; 植物细胞动物细胞 2 .植物组织培养

9、技术一-试一-愈伤组织1 过程：离体的植物器官、组织或细胞一-植物体管苗微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、用途：2细胞产物的工厂化生产 培育植物新品种植物体细胞杂交地位：是培育转基因植物、3的最后一道工序.植物细胞培养苏教版3.概念：在实验室工厂化生产的条件下,将组织培养过程中1 悬或其他易分散的组织置于液体培养基中,进行形成的愈伤组织 使细胞增殖,继代培养悬浮细胞,通过浮培养,得到分散游离的 的一种技术.从而获得大量的细胞群体 2组织培养是根底.植物 ,植目的不同：植物组织培养的目的是得到更多的植物体 的是获得人类所需的细胞物细胞培养的目 抗红豆杉的细胞,从中提取出重要的3实例：

10、成功地培养 肿瘤药物一一紫杉醇. 4.植物体细胞杂交技术过程：1声刃愈伤组级再岁人杂忤棺便作等.化学法一般是用聚乙二醇PEG2诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激为诱导剂. 克服了远缘杂交不亲和的障碍.3意义：二动物细胞工程动物细胞培养 1.,然后放在,将它分散成单个细胞概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的1组织生长和繁殖.适宜的培养基中,让这些细胞胰-剪碎-用2 动物细胞培养的流程：取动物组织块动物胚胎或幼龄动物的器官或组织_ 培养-原代细胞悬液-转入培养瓶中进行处理分散成蛋白酶或胶原蛋白酶单个细胞-制成 传代培养.贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶 或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞

11、继续 o细胞数目细胞贴壁细胞贴壁和接触抑制：悬 液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为3 这种现象称时,细胞就会停止分裂增殖不断增多,当贴壁细胞分裂生长到外表相互抑制 细胞的接触抑制为. 动物细胞培养需要满足以下条件4.无菌、无毒的环境：培养液应进行 无菌处理.通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防 培养过程中的污染.此外,应定期更换培养液,预防代谢产物积累对细胞 自身造成危害.营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等.通常需参加血清、血浆等天然成分.温度：适宜温度：哺乳动物多是 36.5 C+ 0.5 C ; pH: 7.27.4.气体环境：95戏气+5%CO O

12、是细胞代谢所必需的,CO的主要作用是 维持培养液的pH.225动物细胞培养技术的应用：制备病毒 疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞.2 .动物组织培养苏教版：动物细胞培养与动物组织培养方法类似,主要区别是动物细胞培养过程中需要用 胰蛋白酶 等使组织块中的细胞 离散,而动物组织培养过程中不需要使用胰蛋白酶等.一3 .动物体细胞核移植技术和克隆动物1哺乳动物核移植可以分为 胚胎细胞 核移植比拟容易和体细胞 核移植比拟难.2选用去核 卵母细胞的原因：卵母细胞比拟大,容易操作；卵母细胞细胞质多,营养丰富.3选探 黑体阳隼盘体堂聿I I同期发情处建I端装排卵I供件去牛 EftIi

13、顼餐检毒.搐瘩其能苓埴I蚯脂檎亚I分模狂周裕机的骸华核移植胚胎移植4体细胞核移植技术的应用：保护濒危物种,增大存活数量;加速家畜遗传改进进程,促进良畜群繁育;生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等 .(5)体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出 遗传和生理 缺陷等.4 .动物细胞融合(1)动物细胞融合也称 细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程.融合后 形成的具有原来 两个或多个 细胞遗传信息的单核细胞,称为杂交细胞. (2)动物细胞融合与植物原生质体融合的原理根本相同,诱导动物细胞融合的方法与植物原生 质体融合的方法类似,常用的诱导因

14、素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等.(3)动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育 的重要手段.(4)动物细胞融合与植物体细胞杂交的比拟:aaaaaaaaaaa淋巴细胞B骨髓 瘤细胞别离抗原注入小鼠体内 比拟工程aa细胞融合的原理aa细胞融合的方法aa诱导手段aa用法aaa胞杂交植物体细aa细胞膜的流动性aaa导原生质体融 合去除细胞壁后 诱 aaaaa等试剂诱导聚乙 二醇振动,离心、 电刺激、aaaaa杂种植 株获得的 不亲和 性,克服 了远缘杂 交aaa融合动物细胞aa细胞膜的流动性aaa导细胞融合使 细胞分散后诱 aaaaa毒诱导再加灭活 的病胞杂交手段 外,除应用植物细aaa的技术之一制备单克隆抗体5.单克隆抗体(1)抗体：一个 B淋巴细胞只分泌一种 特异性抗体.从血清中别离出的抗体产量低、纯度低、特异性差.(2)单克隆抗体